CRISPR) ഒരു മൂന്നാം തലമുറ ജീനോം എഡിറ്റിംഗ് സാങ്കേതികതയാണ്: CRISPR ലോകത്തെ വിപ്ലവകരമായി മാറ്റി.

ക്ലസ്റ്റേർഡ് റെഗുലർലി ഇന്റർസ്‌പേസ്ഡ് ഷോർട്ട് പാലിൻഡ്രോമിക് റിപ്പീറ്റുകൾ (CRISPR) എന്നത് മൂന്നാം തലമുറയിലെ ജീനോം എഡിറ്റിംഗ് ടെക്‌നിക്കാണ്, ഇത് അതിന്റെ ഉയർന്ന ത്രൂപുട്ട് ഫലങ്ങളാൽ ലോകത്തെ വിപ്ലവകരമായി മാറ്റി. വിവിധ ജൈവ രോഗങ്ങളെയും അണുബാധകളെയും ചികിത്സിക്കാൻ ഇത് ഉപയോഗിച്ചുവരുന്നു. വിവിധ ബാക്ടീരിയകൾക്കും മറ്റ് പ്രോകാരിയോട്ടുകൾക്കും (ആർക്കിയ പോലുള്ളവ) ഫേജുകൾക്കെതിരെ പ്രതിരോധിക്കാൻ CRISPR/Cas9 സംവിധാനങ്ങളുണ്ട്. CRISPR/Cas9 അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള തന്ത്രങ്ങൾക്ക് മാറ്റം വരുത്തിയ പ്രതിരോധ ജീനുകൾ, ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ, എപ്പിജെനെറ്റിക് റെഗുലേഷൻ എന്നിവ ലക്ഷ്യമിട്ട് ട്രിപ്പിൾ നെഗറ്റീവ് സ്തനാർബുദത്തിന്റെ (TNBC) വളർച്ചയെയും പുരോഗതിയെയും തടയാൻ കഴിയുമെന്ന് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. TNBC-യിൽ പോലും കാണപ്പെടുന്ന മയക്കുമരുന്ന് പ്രതിരോധം പോലുള്ള വെല്ലുവിളി നിറഞ്ഞ പ്രശ്നങ്ങൾ പരിഹരിക്കാൻ ഈ ചികിത്സാ ഇടപെടലുകൾ സഹായിച്ചേക്കാം. നിലവിൽ, ഫിസിക്കൽ (മൈക്രോഇൻജക്ഷൻ, ഇലക്ട്രോപോറേഷൻ, ഹൈഡ്രോഡൈനാമിക് മോഡുകൾ), വൈറൽ (അഡിനോ-അസോസിയേറ്റഡ് വൈറസ്, ലെന്റിവൈറസ്), വൈറൽ അല്ലാത്ത (ലിപ്പോസോമുകൾ, ലിപിഡ് നാനോപാർട്ടിക്കിളുകൾ) പോലുള്ള ടാർഗെറ്റ് സെല്ലുകളിലേക്ക് CRISPR/Cas9 എത്തിക്കുന്നതിന് വിവിധ രീതികൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു. ടിഎൻബിസിയുടെ തന്മാത്രാ കാരണങ്ങൾ പഠിക്കുന്നതിനായി വിവിധ മോഡലുകൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, ഇൻ വിവോയിൽ ജീനോം എഡിറ്റിംഗ് ഉപകരണങ്ങൾ നൽകുന്നതിനുള്ള സെൻസിറ്റീവും ലക്ഷ്യബോധമുള്ളതുമായ രീതികളുടെ അഭാവം അവയുടെ ക്ലിനിക്കൽ പ്രയോഗത്തെ പരിമിതപ്പെടുത്തുന്നു. ചുരുക്കത്തിൽ, നിലവിലുള്ള തെളിവുകളുടെ അടിസ്ഥാനത്തിൽ ടിഎൻബിസിക്കുള്ള CRISPR/Cas9 ചികിത്സയുടെ പുരോഗതി, വെല്ലുവിളികൾ, പരിമിതികൾ, സാധ്യതകൾ എന്നിവ ഈ അവലോകനം സമഗ്രമായി പരിശോധിക്കുന്നു. കൃത്രിമബുദ്ധിയുടെയും മെഷീൻ ലേണിംഗിന്റെയും സംയോജനം ടിഎൻബിസിയുടെ ചികിത്സയിൽ CRISPR/Cas9 തന്ത്രങ്ങൾ എങ്ങനെ മെച്ചപ്പെടുത്തുമെന്ന് ഞങ്ങൾ എടുത്തുകാണിക്കുന്നു.
അനിയന്ത്രിതമായ കോശവിഭജനം, കോശചക്ര ചെക്ക്‌പോസ്റ്റുകളുടെ തടസ്സം, ട്യൂമർ സപ്രസ്സർ ജീനുകളിലെ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ (TSGs) എന്നിവയാണ് കാൻസറിന്റെ സവിശേഷത (മാത്യൂസ് തുടങ്ങിയവർ, 2022). വ്യത്യസ്ത തരം കാൻസറുകളിൽ, സ്ത്രീകളിൽ ഏറ്റവും സാധാരണമായ കാൻസറാണ് സ്തനാർബുദം, ലോകമെമ്പാടും ഉയർന്ന മരണനിരക്കും ഉണ്ട് (വാക്സ് ആൻഡ് വൈനർ, 2019). ഹിസ്റ്റോളജിക്കൽ, ബയോളജിക്കൽ സവിശേഷതകൾ, ക്ലിനിക്കൽ അവതരണം, പെരുമാറ്റം, ചികിത്സയോടുള്ള പ്രതികരണം എന്നിങ്ങനെ വൈവിധ്യമാർന്ന സ്വഭാവസവിശേഷതകളുള്ള ഒരു വൈവിധ്യമാർന്ന രോഗമാണ് സ്തനാർബുദം (വീഗെൽറ്റ് തുടങ്ങിയവർ, 2010). സ്തനാർബുദ വർഗ്ഗീകരണം സ്തനാർബുദ രോഗനിർണയത്തിനും ട്യൂമർ രോഗനിർണയത്തിനും കൃത്യമായ ഉൾക്കാഴ്ച നൽകുന്നു. സാധാരണ ബയോമാർക്കറുകളുടെയും ക്ലിനിക്കോപാത്തോളജിക്കൽ സവിശേഷതകളുടെയും ഉപയോഗമാണ് സ്തനാർബുദ വർഗ്ഗീകരണത്തിനുള്ള പ്രധാന മാനദണ്ഡം (സാങ് ആൻഡ് ത്സെ, 2019). സ്തനാർബുദ ചികിത്സയ്ക്കുള്ള രോഗനിർണയവും പ്രതികരണവും ഈസ്ട്രജൻ റിസപ്റ്റർ (ER), പ്രോജസ്റ്ററോൺ റിസപ്റ്റർ (PR), ഹ്യൂമൻ എപ്പിഡെർമൽ ഗ്രോത്ത് ഫാക്ടർ റിസപ്റ്റർ 2 (HER2/neu), ഹിസ്റ്റോളജിക്കൽ ഗ്രേഡ്, ട്യൂമർ തരം, ഗ്രേഡ് എന്നിവയുടെ സാന്നിധ്യം ഉൾപ്പെടെ നിരവധി ഘടകങ്ങളാൽ സ്വാധീനിക്കപ്പെടുന്നു. വലുപ്പവും ലിംഫ് നോഡ് മെറ്റാസ്റ്റാസിസും (അൽ-തുബൈതി, 2020). ലുമിനൽ എ, ലുമിനൽ ബി, എച്ച്ഇആർ2-സമ്പുഷ്ടം, ബേസൽ-ലൈക്ക്, ക്ലോഡിൻ-ലോ (പ്രാറ്റ് എറ്റ് ആൽ., 2015) എന്നിവയുൾപ്പെടെ സ്തനാർബുദത്തിന്റെ അഞ്ച് ആന്തരിക തന്മാത്രാ ഉപവിഭാഗങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട്. ടിഎൻബിസി എല്ലാ ഇആർ, പിആർ, എച്ച്ഇആർ2 എന്നിവ പ്രകടിപ്പിക്കാത്ത കാൻസറിന്റെ ഒരു തന്മാത്രാ ഉപവിഭാഗമാണ് (യിൻ എറ്റ് ആൽ., 2020). ഈ രോഗാവസ്ഥാ സവിശേഷതകൾ ടിഎൻബിസിയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, ഇത് മറ്റ് ഏത് തരത്തിലുള്ള സ്തനാർബുദത്തേക്കാളും അതിന്റെ ദ്രുതഗതിയിലുള്ള പുരോഗതിയും കൂടുതൽ ആക്രമണാത്മക സ്വഭാവവും സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു (ഫെങ് എറ്റ് ആൽ., 2018). കൂടാതെ, പെറു എറ്റ് ആൽ (2000) സ്തനാർബുദത്തെ വീണ്ടും തരംതിരിക്കാനും സ്തനാർബുദത്തിന്റെ അഞ്ച് ആന്തരിക ഉപവിഭാഗങ്ങളെ തിരിച്ചറിയാനും മൈക്രോഅറേ സാങ്കേതികവിദ്യ ഉപയോഗിച്ചു (കാഡെനാസ്, 2012). ബേസൽ പോലുള്ള സ്തനാർബുദം ട്രിപ്പിൾ-നെഗറ്റീവ് ഫിനോടൈപ്പ് ഉള്ളതും ദ്രുതഗതിയിലുള്ള പുരോഗതിയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടതുമായ സ്തനാർബുദത്തിന്റെ ഒരു ഉപവിഭാഗമാണ്. ബേസൽ പോലുള്ള എല്ലാ സ്തനാർബുദങ്ങളും സാധാരണയായി TNBC ആയി തെറ്റായി നിർണ്ണയിക്കപ്പെടുന്നു, എന്നാൽ 77% മാത്രമേ TNBC ആണെന്ന് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്; ഇതിനു വിപരീതമായി, TNBC യുടെ 71–91% ബേസൽ പോലുള്ളവയാണ്, ഇത് ഈ രണ്ട് തരം സ്തനാർബുദങ്ങളും ഓവർലാപ്പ് ചെയ്യുകയും വ്യത്യസ്ത വർഗ്ഗീകരണങ്ങളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുകയും ചെയ്യുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (Wang D.-Y. et al., 2019). രോഗനിർണയം വ്യക്തമാക്കുന്നതിനും നിലവിലുള്ളതും ഭാവിയിലുമുള്ള ചികിത്സകളോടുള്ള സാധ്യതയുള്ള പ്രതികരണങ്ങൾ തിരിച്ചറിയുന്നതിനും TNBC യുടെ വൈവിധ്യത്തെ ചിത്രീകരിക്കേണ്ടതിന്റെ ആവശ്യകത ഇത് സൃഷ്ടിക്കുന്നു. കൂടാതെ, എല്ലാ സ്തനാർബുദ കേസുകളിലും 15–20% TNBC ആണ്, കൂടാതെ 50 വയസ്സിന് താഴെയുള്ള സ്ത്രീകളിലാണ് ഇത് കൂടുതൽ സാധാരണമായത്. ഏകദേശം 20% TNBC കേസുകളിലും BRCA1 അല്ലെങ്കിൽ BRCA2 മ്യൂട്ടേഷനുകൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട് (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2020). ഉയർന്ന അളവിലുള്ള വാസ്കുലർ എൻഡോതെലിയൽ വളർച്ചാ ഘടകങ്ങൾ, ട്യൂമർ-അസോസിയേറ്റഡ് മാക്രോഫേജുകൾ (TAM-കൾ), ട്യൂമർ-ഇൻഫിൽട്രേറ്റിംഗ് ലിംഫോസൈറ്റുകൾ (TIL-കൾ), ട്യൂമർ വളർച്ചയിലും കുടിയേറ്റത്തിലും ഉൾപ്പെടുന്ന മറ്റ് തന്മാത്രകൾ എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്ന ഒരു പ്രത്യേക രോഗപ്രതിരോധ സൂക്ഷ്മ പരിസ്ഥിതി TNBC-യ്ക്കുണ്ടെന്ന് പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്. അതിനാൽ, TNBC-യുടെ സൂക്ഷ്മ പരിസ്ഥിതി മനസ്സിലാക്കുന്നത് അതിന്റെ രോഗനിർണയത്തിനും ചികിത്സയ്ക്കും നിർണായകമാണ് (ഫാൻ ആൻഡ് ഹെ, 2022).
ടിഎൻബിസിയുടെ രോഗനിർണയം വിലയിരുത്തുന്നതിനും ഫലപ്രദമായ ചികിത്സ ഉറപ്പാക്കുന്നതിനും, പ്രധാനമായും ഇആർ, പിആർ, എച്ച്ഇആർ2 എന്നിവ കണ്ടെത്തുന്നതിനുള്ള ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിസ്ട്രി (ഐഎച്ച്സി), സ്തന നിയോപ്ലാസങ്ങൾ കണ്ടെത്തുന്നതിനുള്ള മാമോഗ്രാഫി എന്നിവയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള കൃത്യമായ രോഗനിർണയം പ്രധാനമാണ്. എന്നിരുന്നാലും, നെക്രോസിസ്, ഫൈബ്രോസിസ് തുടങ്ങിയ ഇൻട്രാട്യൂമറൽ സവിശേഷതകളെ മാമോഗ്രാഫിക്ക് വേണ്ടത്ര ചിത്രീകരിക്കാൻ കഴിയില്ല (ദീപക് സിംഗ് തുടങ്ങിയവർ, 2021). മോശം രോഗനിർണയവും രോഗനിർണയവും ശരിയായ മരുന്നുകൾ നിർദ്ദേശിക്കുന്നതിൽ നിന്ന് ഡോക്ടർമാരെ തടയുന്നതിനാൽ (ചൗധരി, 2020), ടിഎൻബിസി രോഗികളുടെ പരിചരണം മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിന് വിവിധ തന്ത്രങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു. നിലവിൽ, ഡോക്സോരുബിസിൻ, സൈക്ലോഫോസ്ഫാമൈഡ് എന്നീ രണ്ട് മരുന്നുകൾ ടിഎൻബിസി രോഗികളിൽ ഉപയോഗിക്കുന്നു, അവ നല്ല ഫലങ്ങൾ കാണിച്ചിട്ടുണ്ട്. കൂടാതെ, കാർബോപ്ലാറ്റിൻ, സിസ്പ്ലാറ്റിൻ പോലുള്ള മറ്റ് പ്ലാറ്റിനം മരുന്നുകളും ഉപയോഗിക്കുന്നു (സിക്കോവ് തുടങ്ങിയവർ, 2015). കൂടാതെ, ഒലാപാരിബ്, വെലാപാരിബ്, പിഎഫ്-01367338 തുടങ്ങിയ പിഎആർപി ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ ടിഎൻബിസിയുടെ ചികിത്സയ്ക്കുള്ള സാധ്യതയുള്ള കീമോതെറാപ്പി മരുന്നുകളായി ഉപയോഗിച്ചുവരുന്നു (ഇഷിനോ തുടങ്ങിയവർ, 2018). Wnt/b-Catenin, NOTCH, Hedgehog സിഗ്നലിംഗ് പാതകൾ TNBC യുടെ സംഭവവികാസത്തിലും പുരോഗതിയിലും ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്നതായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുള്ളതിനാൽ, ഈ പാതകളിലേക്ക് മരുന്നുകളെ ലക്ഷ്യം വയ്ക്കുന്നത് ഒരു പ്രധാന തന്ത്രമായിരിക്കാം (Aysola et al., 2013). ശസ്ത്രക്രിയ, റേഡിയേഷൻ തെറാപ്പി, കീമോതെറാപ്പി എന്നിവ ഇന്ന് TNBC യുടെ ചികിത്സയുടെ പ്രധാന കേന്ദ്രമായി നിലനിൽക്കുന്നുണ്ടെങ്കിലും, ടാർഗെറ്റഡ് തെറാപ്പി, ഇമ്മ്യൂണോതെറാപ്പി, Cas9n, dCas9 പോലുള്ള വിവിധ CRISPR-അനുബന്ധ ജീൻ എഡിറ്റിംഗ് ഉപകരണങ്ങൾ എന്നിവയുൾപ്പെടെ പുതിയ ചികിത്സകൾ വികസിപ്പിക്കുന്നതിൽ ഗണ്യമായ പുരോഗതി കൈവരിച്ചിട്ടുണ്ട്. , CRISPR/Cas12, പ്രൈം എഡിറ്റിംഗ്, CRISPR/Cas9-ടാർഗെറ്റഡ് ജീൻ തെറാപ്പി. TNBC യുടെ ചികിത്സയിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന വിവിധ CRISPR-അനുബന്ധ ജീൻ എഡിറ്റിംഗ് ഉപകരണങ്ങളിൽ നമ്മൾ ഇവിടെ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിക്കും. അവയിൽ, CRISPR/Cas9 വ്യാപകമായ ശ്രദ്ധ നേടി.
Cas9 nickase എന്നും അറിയപ്പെടുന്ന Cas9n, CRISPR/Cas9 ജീനോം എഡിറ്റിംഗ് സിസ്റ്റത്തിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ Cas9 പ്രോട്ടീനിന്റെ ജനിതകമായി രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത ഒരു വകഭേദമാണ് (Gupta et al., 2019). അതിന്റെ യഥാർത്ഥ രൂപത്തിൽ, Cas9 പ്രോട്ടീനിൽ രണ്ട് ന്യൂക്ലീസ് ഡൊമെയ്‌നുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു: RuvC, HNH, ഇതിന്റെ പ്രധാന പ്രവർത്തനം രണ്ട് DNA സ്ട്രോണ്ടുകളുടെയും പിളർപ്പാണ്. എന്നിരുന്നാലും, Cas9n-ൽ, ന്യൂക്ലീസ് ഡൊമെയ്‌നുകളിൽ ഒന്നായ HNH, ജനിതകമായി പരിവർത്തനം ചെയ്യപ്പെട്ട് നിഷ്ക്രിയമാകുന്നു. അതിനാൽ, Cas9n-ന്റെ HNH ഡൊമെയ്‌ൻ പ്രവർത്തനരഹിതമായി തുടരുന്നു. RuvC ഡൊമെയ്‌ൻ മാത്രമേ സജീവമായി നിലനിൽക്കുന്നുള്ളൂ, ഇത് Cas9n-നെ ഒറ്റ DNA സ്ട്രോണ്ടുകളിൽ മുറിക്കാനോ ബ്രേക്കുകൾ സൃഷ്ടിക്കാനോ അനുവദിക്കുന്നു (Trevino and Zhang, 2014). Cas9-നെ അപേക്ഷിച്ച്, Cas9n-ന് ഓഫ്-ടാർഗെറ്റ് ഇഫക്റ്റുകൾ ഫലപ്രദമായി കുറയ്ക്കാനും സെൽ റിപ്പയർ മെക്കാനിസങ്ങൾ കൃത്യമായി മെച്ചപ്പെടുത്താനും കഴിയും. ഡബിൾ-സ്ട്രാൻഡഡ് DNA-യിലെ നിർദ്ദിഷ്ട സ്ഥലങ്ങളിൽ ബ്രേക്കുകൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നത് പോലുള്ള വിവിധ പ്രശ്നങ്ങൾ പരിഹരിക്കാൻ Cas9n ഉപയോഗിക്കാം. ഈ ആവശ്യത്തിനായി, രണ്ട് Cas9n തന്മാത്രകൾ സംയോജിപ്പിച്ച് ഒരുമിച്ച് ഉപയോഗിച്ചു (Yee, 2016). മിക്സഡ് ലൈനേജ് കൈനേസ് 3 (MLK3) എന്നത് ഒരു മൈറ്റോജെൻ-ആക്ടിവേറ്റഡ് പ്രോട്ടീൻ കൈനേസാണ്, ഇത് TNBC മെറ്റാസ്റ്റാസിസ് സമയത്ത് ഒരു പ്രധാന റെഗുലേറ്ററായി പ്രവർത്തിക്കുന്നു (ക്രോണൻ തുടങ്ങിയവർ, 2012).
ടിഎൻബിസി മെറ്റാസ്റ്റാസിസിലേക്ക് നയിക്കുന്ന ഒന്നിലധികം സിഗ്നലിംഗ് പാതകളെ എംഎൽകെ3 സജീവമാക്കും. ഉദാഹരണത്തിന്, സി-ജൂൺ എൻ-ടെർമിനൽ കൈനേസ് (ജെഎൻകെ) പാത സെൽ മോട്ടിലിറ്റിയെയും എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ മാട്രിക്സ് ഡീഗ്രേഡേഷനെയും നിയന്ത്രിക്കുന്നു, കൂടാതെ എംഎൽകെ3 ജെഎൻകെ പാതയെ സജീവമാക്കുന്നു, അതുവഴി സെൽ മോട്ടിലിറ്റി വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ആക്രമണാത്മക ഗുണങ്ങൾ നൽകുകയും ചെയ്യുന്നു (രട്ടാനസിഞ്ചായിയും ഗാലോയും, 2016). എംഎൽകെ3 ഇഎംടിയെയും നിയന്ത്രിക്കുന്നു. ഇത് ചെയ്യുന്നതിന്, സ്നൈൽ, സ്ലഗ്, ട്വിസ്റ്റ് തുടങ്ങിയ ഡൗൺസ്ട്രീം ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളെ ഇത് സജീവമാക്കുന്നു. ഈ ഘടകങ്ങൾ എപ്പിത്തീലിയൽ മാർക്കറുകളുടെ പ്രകടനത്തെ തടയുകയും മെസെൻചൈമൽ മാർക്കറുകളുടെ പ്രകടനത്തെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു, ഇത് ഒരു മെറ്റാസ്റ്റാറ്റിക് ഫിനോടൈപ്പ് ഏറ്റെടുക്കുന്നതിലേക്ക് നയിക്കുന്നു (കാസലിനോ മറ്റുള്ളവരും, 2023). ഇസിഎം പുനർനിർമ്മിക്കുന്നതിലും ഇസിഎമ്മിനെ തരംതാഴ്ത്തുന്ന മാട്രിക്സ് മെറ്റലോപ്രോട്ടീനേസുകൾ (എംഎംപികൾ) പോലുള്ള പ്രോട്ടീസുകളുടെ സജീവമാക്കലിലും എംഎൽകെ3 ഒരു പങ്കു വഹിക്കുന്നതായി നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. ഇത് ട്യൂമർ സെൽ അധിനിവേശത്തിനും വിദൂര സ്ഥലങ്ങളിലേക്ക് വ്യാപിക്കുന്നതിനും സഹായിക്കുന്നു (കാറ്റരി മറ്റുള്ളവരും, 2019). അങ്ങനെ, ടിഎൻബിസിയിൽ എംഎൽകെ3 നിർണായക പങ്ക് വഹിക്കുന്നുണ്ടെന്ന് മുൻ പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്. രത്തനസിഞ്ചായിയും ഗാലോയും MLK3 യുടെ പങ്ക് പഠിക്കാൻ TNBC മോഡലുകൾ ഉപയോഗിച്ചു, അത് നിർദ്ദിഷ്ട സിഗ്നലിംഗ് പാതകളിലൂടെ കാൻസർ വികസനം പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് കണ്ടെത്തി. MLK3 എഡിറ്റ് ചെയ്യാൻ അവർ CRISPR/Cas9n ഉപയോഗിച്ചു, TNBC മെറ്റാസ്റ്റാസിസിൽ ഗണ്യമായ കുറവ് അവർ നിരീക്ഷിച്ചു (രത്തനസിഞ്ചായിയും ഗാലോയും, 2016).
നിഷ്‌ക്രിയ Cas9 എന്ന് വിളിക്കപ്പെടുന്ന dCas9, Cas9 പ്രോട്ടീനിന്റെ പരിഷ്‌ക്കരിച്ച ഒരു ഡെറിവേറ്റീവ് രൂപമാണ്. സജീവമായ Cas9-ൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായി, dCas9-ന് എൻഡോന്യൂക്ലീസ് പ്രവർത്തനം ഇല്ല, ഇത് DNA ഡബിൾ-സ്ട്രാൻഡ് ബ്രേക്കുകൾ പ്രേരിപ്പിക്കാൻ കഴിയില്ല. അതിനാൽ, DNA ശ്രേണിയിൽ മാറ്റങ്ങളോ മാറ്റങ്ങളോ ഇല്ലാതെ ജീനോമിന്റെ നിർദ്ദിഷ്ട പ്രദേശങ്ങളെ കൃത്യമായി ലക്ഷ്യം വയ്ക്കാൻ dCas9 ഉപയോഗിക്കാം (Wang et al., 2016). dCas9-ൽ, രണ്ട് എൻഡോന്യൂക്ലീസ് പ്രോട്ടീനുകളായ RuvC, HNH എന്നിവ പ്രധാനപ്പെട്ട അമിനോ ആസിഡ് അവശിഷ്ടങ്ങളെ അടിച്ചമർത്തുന്നതിലൂടെ നിർജ്ജീവമാക്കുന്നു. (Richter et al., 2016). DNA ക്ലീവേജ് പ്രവർത്തനത്തിന്റെ അഭാവം ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, dCas9 ജനിതക ഗവേഷണത്തിലും ബയോടെക്നോളജിയിലും നിരവധി പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നു. ഉദാഹരണത്തിന്, ഇത് ജീനോമിന്റെ പ്രത്യേക പ്രദേശങ്ങളുടെ ദൃശ്യവൽക്കരണം അനുവദിക്കുന്നു, ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ നിയന്ത്രണം സുഗമമാക്കുന്നു, എപ്പിജെനെറ്റിക് പരിഷ്കാരങ്ങൾ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നു (Brocken et al., 2018).
ഭ്രൂണ വികസനം, ടിഷ്യു നന്നാക്കൽ, കാൻസർ പുരോഗതി എന്നിവയ്ക്കിടെ സംഭവിക്കുന്ന ഒരു സെല്ലുലാർ പ്രക്രിയയായ എപ്പിത്തീലിയൽ-മെസെൻചൈമൽ ട്രാൻസിഷൻ (EMT) മധ്യസ്ഥമാക്കുന്നതിൽ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകം ZEB1 (സിങ്ക് ഫിംഗർ ഇ-ബോക്സ് ബൈൻഡിംഗ് ഹോമിയോബോക്സ് 1) ഒരു പ്രത്യേകവും നിർണായകവുമായ പങ്ക് വഹിക്കുന്നു. എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളെ മെസെൻചൈമൽ കോശങ്ങളാക്കി മാറ്റുന്നതും കോശ രൂപഘടന, ചലനശേഷി, ആക്രമണാത്മകത മുതലായവയിൽ മാറ്റങ്ങൾ വരുത്തുന്നതും ഇതിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു (Wu et al., 2020). TNBC-യിലെ എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളുടെ കോശ അഡീഷനും ധ്രുവീകരണവും നിലനിർത്തുന്നതിന് ഉത്തരവാദികളായ ഇ-കാതറിൻ, ഒക്ലൂഡിൻ തുടങ്ങിയ ഒന്നിലധികം എപ്പിത്തീലിയൽ മാർക്കറുകളെ ZEB1 തടയുന്നു (Moreno-Bueno et al., 2008). കൂടാതെ, ZEB1 N-കാതറിൻ, വിമെന്റിൻ, ഫൈബ്രോനെക്റ്റിൻ (Konradi et al., 2014) പോലുള്ള ചില മാർക്കറുകളെ സജീവമാക്കുന്നു, കൂടാതെ Rho GTPases, മാട്രിക്സ് മെറ്റലോപ്രോട്ടീനേസുകൾ (MMPs) (Huang) പോലുള്ള സൈറ്റോസ്‌കെലെറ്റൽ പുനർനിർമ്മാണത്തിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന ജീനുകളെ നിയന്ത്രിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു (Huang). et al., 2014). 2022), കൂടാതെ, വളർച്ചാ ഘടകം-β (TGF-β), Wnt സിഗ്നലിംഗ് മുതലായവയെ പരിവർത്തനം ചെയ്യുന്ന വിവിധ സിഗ്നലിംഗ് പാതകളെയും ഇത് ബാധിക്കുന്നു, അതുവഴി TNBC-യിൽ ട്യൂമർ അധിനിവേശവും മെറ്റാസ്റ്റാസിസും പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നു (Chen et al., 2016). നിരവധി പഠനങ്ങളും ശാസ്ത്രീയ തെളിവുകളും സൂചിപ്പിക്കുന്നത് TNBC യുടെ കണ്ടെത്തലിനും ചികിത്സാ ഇടപെടലിനുമുള്ള ഒരു വിലപ്പെട്ട ഏജന്റ് എന്ന നിലയിൽ ZEB1 ന് വലിയ കഴിവുണ്ടെന്നാണ്. സമീപകാല പഠനത്തിൽ, വാര്യ തുടങ്ങിയവർ ഒരു TNBC മോഡൽ ഉപയോഗിക്കുകയും dCas9 വഴി ZEB1 ന്റെ പൂർണ്ണമായ അടിച്ചമർത്തൽ നേടുകയും ചെയ്തു. അങ്ങനെ, ഇൻ വിവോ സാഹചര്യങ്ങളിൽ വളരെ ഉയർന്ന പ്രത്യേകതയും ZEB1 ന്റെ ഏതാണ്ട് പൂർണ്ണമായ തടസ്സവും അവർ നിരീക്ഷിച്ചു (വാർയ തുടങ്ങിയവർ, 2023).
CRISPR/Cas12 എന്നത് CRISPR/Cpf1 എന്ന ജീൻ എഡിറ്റിംഗ് ഉപകരണമാണ്. ഇത് CRISPR/Cas സിസ്റ്റത്തിൽ നിന്നാണ് ഉരുത്തിരിഞ്ഞത്, ഇവിടെ Cas12 എന്ന പദം CRISPR-അസോസിയേറ്റഡ് പ്രോട്ടീൻ 12 (ഭരത്കുമാർ തുടങ്ങിയവർ, 2022) നെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് Cas9 ന് പൂർണ്ണമായും സമാനമാണ്. ഒരേയൊരു വ്യത്യാസം അതിൽ Cas12 പ്രോട്ടീൻ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു എന്നതാണ്. Cas9 നെ അപേക്ഷിച്ച്, Cas12 ന് ജീൻ എഡിറ്റിംഗ് പ്രക്രിയയിൽ സ്റ്റിക്കി അറ്റങ്ങൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നത് പോലുള്ള ചില സവിശേഷ പ്രവർത്തനങ്ങൾ ഉണ്ട്, അതേസമയം Cas9 മങ്ങിയ അറ്റങ്ങൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നു (Wang et al., 2021). Cas12 ന്റെ ഈ ഗുണം അതിന്റെ നിർദ്ദിഷ്ട DNA കൃത്രിമ സാങ്കേതികവിദ്യയ്ക്ക് സംഭാവന നൽകുന്നു. ലക്ഷ്യ DNA കൃത്യമായി തിരിച്ചറിയാനും മുറിക്കാനും കഴിവുള്ള ഒരു പ്രോട്ടീൻ എന്ന നിലയിൽ, ഇതിന് അസാധാരണമായ വൈവിധ്യമുണ്ട്, ഇത് ജീൻ എഡിറ്റിംഗ് ഉൾപ്പെടെ വിവിധ ആപ്ലിക്കേഷനുകൾക്കുള്ള ഫലപ്രദമായ ഉപകരണമാക്കി മാറ്റുന്നു (Pickar-Oliver and Gersbach, 2019).
മറ്റ് CRISPR വകഭേദങ്ങളെപ്പോലെ, CRISPR/Cas12-നും TNBC-യിലെ ജീനുകളെ പുറത്താക്കാനോ സജീവമാക്കാനോ കഴിയും, അതിന്റെ രോഗകാരിയിലോ ചികിത്സയോടുള്ള പ്രതികരണത്തിലോ ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്ന ജീനുകളെ ലക്ഷ്യം വച്ചാണ് ഇത് ചെയ്യുന്നത് (യാങ്, ഷാങ്, 2023). ഈ പ്രക്രിയ പൂർത്തിയാക്കാൻ, Cas12-നെ ലക്ഷ്യ ജീനിലേക്ക് നയിക്കുന്ന ഒരു ഗൈഡ് RNA (gRNA) വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു. Cas12 അതിന്റെ ലക്ഷ്യവുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചുകഴിഞ്ഞാൽ, അത് DNA-യിൽ ഇരട്ട-സ്ട്രാൻഡ് ബ്രേക്കുകൾ അവതരിപ്പിക്കുകയും DNA നന്നാക്കൽ സംവിധാനങ്ങൾ സജീവമാക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. നന്നാക്കൽ പ്രക്രിയയിൽ, തെറ്റായ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ ഉൾപ്പെടുത്താം, ഇത് ജീൻ മ്യൂട്ടേഷനുകളിലേക്കും പ്രവർത്തന നഷ്ടത്തിലേക്കും നയിച്ചേക്കാം (Zhang et al., 2021a). കൂടാതെ, ജീനുകളെ സജീവമാക്കാൻ Cas12 എൻസൈമിന്റെ (dCas12 എന്ന് വിളിക്കപ്പെടുന്നു) മെച്ചപ്പെടുത്തിയ പതിപ്പും ഉപയോഗിച്ചു. ഒരു ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ആക്റ്റിവേറ്ററുമായി ഇത് സംയോജിപ്പിച്ച്, ചില ജീനുകളെ പ്രേരിപ്പിക്കാനും അതുവഴി അവയെ സജീവമാക്കാനും കഴിയും. ട്യൂമർ സപ്രസ്സർ ജീനുകളുടെ സജീവമാക്കൽ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിൽ ഈ സാങ്കേതികവിദ്യയ്ക്ക് വലിയ കഴിവുണ്ട് (സുൽത്താൻ et al., 2022).
പ്രൈം എഡിറ്റിംഗ് എന്നത് പുതുതായി വികസിപ്പിച്ചെടുത്തതും വളരെ മികച്ചതുമായ ഒരു ജീനോം എഡിറ്റിംഗ് സാങ്കേതികവിദ്യയാണ്. ഒരു ജീവിയുടെ ഡിഎൻഎയെ വളരെ കൃത്യമായി പരിഷ്കരിക്കാൻ ഇതിന് കഴിയും (ചെൻ ആൻഡ് ലിയു, 2023). രണ്ട് പ്രധാന ഘടകങ്ങളുടെ സംയോജനത്തിലൂടെയാണ് പ്രൈം എഡിറ്റിംഗ് നേടുന്നത്: പരിഷ്കരിച്ച CRISPR/Cas9 എൻസൈം, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ്. CRISPR/Cas9 എൻസൈമിന്റെ പങ്ക് ജീനോമിലെ കൃത്യമായ സൈറ്റുകളെ തിരഞ്ഞെടുത്ത് ടാർഗെറ്റുചെയ്യുക എന്നതാണ്, അതേസമയം റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് ടാർഗെറ്റ് ലൊക്കേഷനിൽ ഡിഎൻഎയെ നന്നായി പരിഷ്കരിക്കാൻ സഹായിക്കുന്നു (ഹസ്സൻ തുടങ്ങിയവർ, 2021). പ്രൈമർ എഡിറ്റിംഗ് മെക്കാനിസത്തിൽ, ആദ്യ ഘട്ടത്തിൽ ഒരു പ്രൈമർ എഡിറ്റിംഗ് ഗൈഡ് ആർഎൻഎ (പെഗ്ആർഎൻഎ) സൃഷ്ടിക്കുന്നത് ഉൾപ്പെടുന്നു (സ്റ്റാൻഡേജ്-ബീയർ തുടങ്ങിയവർ, 2021). ടാർഗെറ്റ് ഡിഎൻഎയിലെ ആവശ്യമുള്ള എഡിറ്റിംഗ് സൈറ്റുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസും ആർഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റും ഇതിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. തുടർന്ന് പെഗ്ആർഎൻഎയെ ഒരു പ്രൈമർ എഡിറ്റിംഗ് ന്യൂക്ലീസ് (PE2) ഉപയോഗിച്ച് ടാർഗെറ്റ് സെല്ലുകളിലേക്ക് അവതരിപ്പിക്കുന്നു. PE2 ഒരു Cas9 എൻസൈം, ഒരു റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ്, ഒരു പ്രൈമർ എഡിറ്റിംഗ് അഡാപ്റ്റർ എന്നിവ അടങ്ങിയ ഒരു ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീനാണ് (മാർട്ടിൻ-അലോൻസോ തുടങ്ങിയവർ, 2021). സെല്ലിനുള്ളിൽ, pegRNA, PE2 കോംപ്ലക്സുകൾ അവ പരിഷ്കരിക്കാൻ ആഗ്രഹിക്കുന്ന നിർദ്ദിഷ്ട DNA തിരയുന്നു. Cas9 എൻസൈം DNA മുറിച്ച് ഒറ്റ സ്ട്രോണ്ടുകൾ അടങ്ങിയ ഒരു ടെംപ്ലേറ്റ് സൃഷ്ടിക്കുന്നു (Choi et al., 2022). എഡിറ്റിംഗിനായി DNA തയ്യാറാക്കാൻ റിവേഴ്‌സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് ഈ ടെംപ്ലേറ്റ് ഉപയോഗിക്കുന്നു. DNA പകർത്തുന്നതിനൊപ്പം, RNA ടെംപ്ലേറ്റ് എഡിറ്റ് ചെയ്യുന്നതിനുള്ള നിർദ്ദേശങ്ങളും ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്. അവസാനമായി, പുതുതായി സൃഷ്ടിച്ച DNA സ്ട്രാൻഡ് DNA-യിലെ ബ്രേക്ക് നന്നാക്കാൻ ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിക്കുന്നു, ഇത് ആവശ്യമുള്ള പരിഷ്ക്കരണം ഉൾക്കൊള്ളുന്ന ഒരു മാറ്റം വരുത്തിയ DNA ശ്രേണിയിൽ കലാശിക്കുന്നു (Ochoa-Sanchez et al., 2021). പ്രൈമർ എഡിറ്റിംഗ് സംവിധാനങ്ങൾ ജീനുകളിൽ വ്യാപകമായ മ്യൂട്ടേഷനുകൾക്ക് കാരണമാകും. പോയിന്റ് മ്യൂട്ടേഷനുകൾ, ഇൻസേർഷനുകൾ, ഇല്ലാതാക്കലുകൾ, ജീൻ മാറ്റിസ്ഥാപിക്കലുകൾ എന്നിവ പോലും ഇതിന് ലക്ഷ്യമിടാൻ കഴിയും (Anzalone et al., 2019; Chen and Liu, 2023). മുൻ ജീനോം എഡിറ്റിംഗ് സാങ്കേതികവിദ്യകളെ അപേക്ഷിച്ച് പ്രൈം എഡിറ്റിംഗ് നിരവധി ഗുണങ്ങൾ വാഗ്ദാനം ചെയ്യുന്നു. ഇതിൽ വർദ്ധിച്ച കൃത്യത, കുറഞ്ഞ ഓഫ്-ടാർഗെറ്റ് ഇഫക്റ്റുകൾ, DNA ഡബിൾ-സ്ട്രാൻഡ് ബ്രേക്കുകളെ ആശ്രയിക്കാതെ DNA എഡിറ്റ് ചെയ്യാനുള്ള കഴിവ് എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു (Anzalone et al., 2020).
പ്ലാസ്മിഡ് ട്രാൻസ്ഫർ, ഫേജ് അണുബാധ എന്നിവയിൽ നിന്ന് ബാക്ടീരിയകളെ സംരക്ഷിക്കുന്നതിനാണ് CRISPR/Cas9 സാങ്കേതികവിദ്യ ആദ്യം വികസിപ്പിച്ചെടുത്തത്, പിന്നീട് ജീനോം എഡിറ്റിംഗിനായി ഫലപ്രദമായ RNA-അധിഷ്ഠിത DNA ടാർഗെറ്റിംഗ് ഉപകരണമായി പുനർനിർമ്മിച്ചു (ജിയാങ്, ഡൗഡ്ന, 2017). കൂടാതെ, CRISPR/Cas9 സിസ്റ്റം യഥാക്രമം 50% ഉം 87% ഉം ബാക്ടീരിയ, ആർക്കിയൽ ജീനോമുകളിൽ ഉണ്ടെന്ന് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട് (ഇഷിനോ തുടങ്ങിയവർ, 2018). ഇൻ വിവോ, ഇൻ വിട്രോ മോഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഏതെങ്കിലും അസാധാരണ ജനിതക ശ്രേണി ഇല്ലാതാക്കുന്നതിനും ചേർക്കുന്നതിനും തിരുത്തുന്നതിനുമുള്ള ഒരു സാധ്യതയുള്ള ഉപകരണമാണ് CRISPR/Cas9 (സാബിത് തുടങ്ങിയവർ, 2021). മാത്രമല്ല, താൽപ്പര്യമുള്ള ടാർഗെറ്റ് ജീനുകൾക്കായുള്ള പ്രത്യേകത കാരണം CRISPR/Cas9 അഡാപ്റ്റീവ് രോഗപ്രതിരോധ സംവിധാനത്തിന്റെ ഭാഗമാണെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട് (ചെൻ, ഷാങ്, 2018).
CRISPR/Cas9-ൽ Cas9 ഉം ഒരു സിംഗിൾ ഗൈഡ് RNA (sgRNA) ഉം അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. ഒന്നിലധികം പ്രോട്ടീൻ ഘടകങ്ങൾ ചേർന്ന ഒരു എൻഡോന്യൂക്ലീസാണ് Cas9. കൂടാതെ, Cas9-ന് സവിശേഷമായ ഘടനാപരവും രൂപാന്തരപരവുമായ ഗുണങ്ങളുണ്ട് (Pacesa et al., 2022) കാരണം അതിൽ രണ്ട് ലോബുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു: റെക്കഗ്നിഷൻ (REC), ന്യൂക്ലീസ് (NUC). REC ലോബിനെ മൂന്ന് മേഖലകളായി തിരിച്ചിരിക്കുന്നു: REC1, REC2, ബ്രിഡ്ജ് ഹെലിസുകൾ (Cromwell et al., 2018). NUC-യിൽ RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH, പ്രോട്ടോസ്പേസർ അണ്ടർബസ്റ്റന്റ് മോട്ടിഫ് (PAM) ഇന്ററാക്ഷൻ ഡൊമെയ്ൻ (ചിത്രം 1) (സോംഗ് et al., 2016) എന്നിങ്ങനെ മൂന്ന് ലോബുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. sgRNA-യിൽ CRISPR RNA (crRNA), ട്രാൻസ്കോഡിംഗ് സ്മോൾ RNA (ട്രേസർ RNA) (ചിത്രം 1) എന്നിവയുൾപ്പെടെ രണ്ട് ഘടകങ്ങൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. sgRNA, Cas9 പ്രോട്ടീനിനെ കണെക്സിനുകളുമായി ബന്ധിപ്പിച്ച് ഒരു സജീവ സമുച്ചയം രൂപപ്പെടുത്തുന്നു, ഇത് ഇഫക്റ്റർ കോംപ്ലക്സ് എന്നും അറിയപ്പെടുന്നു (Richter et al., 2012). crRNA എന്നത് 18-20 ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് ബേസ് ജോഡിയാണ്, ഇത് ടാർഗെറ്റ് DNA സീക്വൻസുകളെ തിരിച്ചറിയുന്നതിൽ നിർണായക പങ്ക് വഹിക്കുന്നു. കൂടാതെ, crRNA ടാർഗെറ്റ് DNA യുമായി ജോടിയാക്കുന്നു, കൂടാതെ tracrRNA ടാർഗെറ്റ് DNA യെ ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് Cas9 ന്യൂക്ലീസിനുള്ള ഒരു സ്കാഫോൾഡായി പ്രവർത്തിക്കുന്നു (Manghwar et al., 2019). മറുവശത്ത്, PAM സീക്വൻസിൽ 3 ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ ഉണ്ട്, ഇത് ഇഫക്റ്റർ കോംപ്ലക്സിനെ DNA യുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതിനെ സ്ഥിരീകരിക്കുകയും വ്യക്തമാക്കുകയും മധ്യസ്ഥമാക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. Cas9 പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സ് ഉപയൂണിറ്റുകളായ RuvC, HNH എന്നിവയ്ക്ക് കാറ്റലറ്റിക് പ്രവർത്തനം ഉണ്ട് (Richter et al., 2012; Asmamaw and Zawdie, 2021). Cas9 ഉപയൂണിറ്റിന്റെ HNH ന്യൂക്ലീസ് ഡൊമെയ്ൻ crRNA യുമായി ബന്ധപ്പെട്ട DNA സ്ട്രാൻഡിനെ പിളർത്തുന്നു. RuvC ന്യൂക്ലീസ് ഡൊമെയ്ൻ മറ്റ് ഡിഎൻഎ സ്ട്രോണ്ടുകളെ പിളർത്തി ഡബിൾ-സ്ട്രാൻഡ് ബ്രേക്കുകൾ (DSBs) സൃഷ്ടിക്കുന്നു, അതിനുശേഷം രണ്ട് വ്യത്യസ്ത ഡിഎൻഎ ബ്രേക്ക് റിപ്പയർ മെക്കാനിസങ്ങൾ സജീവമാകുന്നു (ജിയാങ് ആൻഡ് ഡൗഡ്ന, 2017) (ചിത്രം 1).
ചിത്രം 1. CRISPR/Cas9 (A) ന്റെ അവലോകനം. CRISPR/Cas9 സിസ്റ്റത്തിന്റെ ഘടകങ്ങൾ: (i). ടാർഗെറ്റ് DNA ശ്രേണി മുറിക്കുന്നതിന് Cas9 എൻഡോന്യൂക്ലീസ് ഉത്തരവാദിയാണ്, (ii) crRNA യുടെയും tra-crRNA ചിമേരകളുടെയും സംയോജനത്തിൽ നിന്ന് ഉണ്ടാകുന്ന ഒരു സിംഗിൾ ഗൈഡ് (sg) RNA. (രണ്ട്). Cas9-ൽ Rec I, Rec II, NUC ലോബ് (HNH, Ruv C എന്നിവ ഉപഘടകങ്ങളാണ്) എന്നിങ്ങനെയുള്ള നിരവധി ഘടകങ്ങൾ ഉൾപ്പെടുന്നു, അനുബന്ധ പ്രവർത്തനങ്ങളുള്ള PAM ഇന്ററാക്ഷൻ ഡൊമെയ്ൻ (C) എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു. CRISPR/Cas9 പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സ് DNA ശ്രേണികളെ പൂരകമല്ലാത്തതും പൂരകവുമായ രൂപങ്ങളിലേക്ക് വിഭജിക്കുന്നു (D). CRISPR/Cas9 മൂന്ന് ഘട്ടങ്ങളിലായി ജീനോമിനെ എഡിറ്റ് ചെയ്യുന്നു: തിരിച്ചറിയൽ, മുറിക്കൽ, നന്നാക്കൽ. രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത sg-RNA Cas9 നെ നയിക്കുകയും പൂരക ഘടകമായ crRNA വഴി ആവശ്യമുള്ള ശ്രേണി തിരിച്ചറിയുകയും ചെയ്യുന്നു. Cas9 5′-NGG-3′-ൽ PAM ശ്രേണി തിരിച്ചറിയുകയും DNA ഉരുകുകയും ചെയ്യുന്നു, ഒരു DNA-RNA ഹൈബ്രിഡ് രൂപപ്പെടുത്തുകയും പിളർപ്പ് സജീവമാക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. Cas9 ന്റെ HNH ഡൊമെയ്ൻ പൂരക സ്ട്രാൻഡിനെ പിളർത്തുന്നു, RuvC ഡൊമെയ്ൻ നോൺ-പൂരക സ്ട്രാൻഡിനെ പിളർത്തുന്നു. CRISPR/Cas9 dsDNA യെ രണ്ട് തരത്തിൽ വിഭജിച്ചുകൊണ്ട് നന്നാക്കുന്നു: നോൺ-ഹോമോലോജസ് എൻഡ് ജോയിനിംഗ് (NHEJ), ഹോമോളജി-ഡയറക്റ്റഡ് റിപ്പയർ (HDR). ക്രമരഹിതമായ DNA സീക്വൻസുകൾ ചേർക്കാനോ നീക്കം ചെയ്യാനോ കഴിയുന്ന ഒരു പിശക് സാധ്യതയുള്ള സംവിധാനമായ എൻസൈമാറ്റിക് പ്രക്രിയയിലൂടെ വിദേശ ഹോമോലോജസ് DNA യുടെ അഭാവത്തിൽ NHEJ ഡബിൾ-സ്ട്രാൻഡഡ് DNA നന്നാക്കുന്നു. HDR വളരെ നിർദ്ദിഷ്ടമാണ്, കൂടാതെ ഹോമോലോജസ് DNA ടെംപ്ലേറ്റുകൾ ആവശ്യമാണ്.
CRISPR/Cas9-മധ്യസ്ഥതയിലുള്ള റിപ്പയർ പാതകളിൽ നോൺ-ഹോമോളോഗസ് എൻഡ് ജോയിനിംഗ് (NHEJ), ഹോമോളജി-ഡയറക്റ്റഡ് റിപ്പയർ (HDR) മെക്കാനിസങ്ങൾ ഉൾപ്പെടുന്നു. NHEJ ഒരു പിശക് സാധ്യതയുള്ള പാതയാണ്, കാരണം അതിൽ ഇൻസേർഷൻ അല്ലെങ്കിൽ ഡിലീറ്റേഷൻ ഉൾപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ റിപ്പയർ മെക്കാനിസത്തിനിടയിൽ ഒരു പാറ്റേണും ആവശ്യമില്ല. സ്റ്റാൻഡേർഡ് പ്രോട്ടീനുകൾ സൃഷ്ടിക്കാൻ ഇത് റാൻഡം ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു (അബ്ബാസി തുടങ്ങിയവർ, 2021). ഈ റിപ്പയർ സിസ്റ്റത്തിൽ KU കോംപ്ലക്സ്, ക്രോസ്-കോംപ്ലിമെന്റിംഗ് പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സ് ടൈപ്പ് 4 (XRCC-4), ഡിഎൻഎ എൻഡ് പ്രോസസ്സിംഗ് എൻസൈം, പ്രോട്ടീൻ കൈനാസ് ഡിഎൻഎ-പികെസികൾ (അബ്ബാസി തുടങ്ങിയവർ, 2021) എന്നിങ്ങനെ നാല് കോംപ്ലക്സുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. KU കോംപ്ലക്സ് പ്രോട്ടീനിന് Ku 70, Ku 80 എന്നീ രണ്ട് ഉപയൂണിറ്റുകൾ ഉണ്ട്, കൂടാതെ NHEJ മെക്കാനിസത്തിൽ ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നു, കാരണം രണ്ട് ഉപയൂണിറ്റുകൾ (Ku 70, Ku 80) ലക്ഷ്യ DNA യുടെ മൂർച്ചയുള്ളതോ ഏതാണ്ട് മൂർച്ചയുള്ളതോ ആയ അറ്റങ്ങളിൽ ബന്ധിപ്പിച്ചാണ് അറ്റകുറ്റപ്പണി സംവിധാനം ആരംഭിക്കുന്നത് (Abbasi et al., 2021), മറ്റ് NHEJ-ബന്ധിത ഘടകങ്ങളെ പരിക്കേറ്റ സ്ഥലത്തേക്ക് റിക്രൂട്ട് ചെയ്യുന്നതിനുള്ള ഒരു സ്കാഫോൾഡായി ഇത് പ്രവർത്തിക്കുന്നു (Yang et al., 2020). XRCC-4 ഉം DNA ലിഗേസും യഥാക്രമം 334 ഉം 911 ഉം അമിനോ ആസിഡുകൾ ചേർന്നതാണ്, കൂടാതെ XRCC4-DNA ലിഗേസ് IV കോംപ്ലക്സ് DNA അറ്റങ്ങളുടെ ലിഗേഷനെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നു (Chatterjee et al., 2015). പോളി ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് കൈനേസ് 3′-ഫോസ്ഫേറ്റ് എന്നും അറിയപ്പെടുന്ന DNA എൻഡ് പ്രോസസ്സിംഗ് എൻസൈമാണ് ഇത്. ഇതിന് DNA യിലെ 3′P ഗ്രൂപ്പ് നീക്കം ചെയ്യാനും DSB റിപ്പയർ സമയത്ത് 5′OH ഗ്രൂപ്പിനെ ഫോസ്ഫോറിലേറ്റ് ചെയ്യാനും കഴിയും. SSB റിപ്പയർ പാത്ത്‌വേ ഉപയോഗിച്ച് സിംഗിൾ-സ്ട്രാൻഡ് ബ്രേക്കുകളുടെ (SSB-കൾ) അറ്റകുറ്റപ്പണിയും ഇതിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു (Chatterjee et al., 2015). പ്രോട്ടീൻ കൈനേസ് DNA-PKcs എന്നത് PIKK-കളുടെ (ഫോസ്ഫാറ്റിഡൈലിനോസിറ്റോൾ 3-കൈനേസ്-ബന്ധിത കൈനേസുകൾ) ഒരു കാറ്റലറ്റിക് സബ്യൂണിറ്റും അറ്റാക്സിയ ടെലാൻജിയക്ടാസിയ മ്യൂട്ടേറ്റഡ് (ATM) കുടുംബവും ATM, Rad3-ബന്ധിത ATR-കളും ഉൾക്കൊള്ളുന്ന ഒരു DNA-ആശ്രിത പ്രോട്ടീൻ കൈനേസാണ്. strand ബ്രേക്കുകൾ (DSB-കൾ), സിംഗിൾ-സ്ട്രാൻഡ് ബ്രേക്കുകൾ (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR കൂടുതൽ കൃത്യവും അനുയോജ്യവുമായ ഒരു നന്നാക്കൽ സംവിധാനമാണ്, കാരണം വിവരങ്ങൾ പകർത്തുന്നത് ഹോമോലോജസ് DNA ഡ്യൂപ്ലെക്സിന്റെ കേടുകൂടാത്ത രൂപം ഉപയോഗിച്ചാണ്, എന്നിരുന്നാലും ഇതിന് സഹോദരി ക്രോമാറ്റിഡുകളുടെ സാന്നിധ്യം ആവശ്യമാണ്. ഇത് സസ്തനി കോശ ചക്രത്തിന്റെ S/G2 ഘട്ടത്തിലാണ് സംഭവിക്കുന്നത്. HDR പ്രധാനമായും യീസ്റ്റ് സ്പീഷീസുകളിലാണ് സംഭവിക്കുന്നത്, എന്നാൽ NHEJ സസ്തനികളിൽ നിർണായകമാണ് (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). പൂർണ്ണമായ നന്നാക്കൽ സംവിധാനം ചിത്രം 1 ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.
ജനിതക, എപ്പിജെനെറ്റിക് അസാധാരണത്വങ്ങൾ മൂലമാണ് TNBC ഉണ്ടാകുന്നതെന്നതിനാൽ, CRISPR/Cas9 ഉപയോഗിച്ച് മാരകമായ ജീനോമിക്/എപ്പിജെനോമിക് അസാധാരണത്വങ്ങൾ തിരുത്തുന്നത് ന്യായമായ ഒരു ചികിത്സാ സമീപനമായിരിക്കാം (Chen et al., 2019). കൂടാതെ, കോശ-നിർദ്ദിഷ്ട ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ നിയന്ത്രണത്തിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന ചില ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങൾ കാൻസർ കോശങ്ങളുടെ സവിശേഷ സവിശേഷതകൾ പ്രകടിപ്പിച്ചേക്കാം, ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ നിയന്ത്രണം കാൻസർ ചികിത്സയ്ക്ക് ഒരു മികച്ച സമീപനമായിരിക്കാമെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (Drost et al., 2017). ജനിതക, എപ്പിജെനെറ്റിക്, ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ വൈകല്യങ്ങൾ പോലുള്ള ട്യൂമറുകളുടെ ഈ തന്മാത്രാ സവിശേഷതകൾ മരുന്നുകളുടെ വികസനത്തിനായി ഉപയോഗപ്പെടുത്തുന്നത് ക്ലിനിക്കൽ ഫലങ്ങൾ മെച്ചപ്പെടുത്താനും സ്ക്രീനിംഗ് ചെലവ് കുറയ്ക്കാനും സഹായിക്കും. കാൻസർ ഉണ്ടാക്കുന്ന ജീനോമിക് ലക്ഷ്യങ്ങൾ കണ്ടെത്താനും തിരിച്ചറിയാനും മാത്രമല്ല, മനുഷ്യകോശങ്ങളിലെ ഓങ്കോജീനുകളെ എഡിറ്റ് ചെയ്യാനും അടിച്ചമർത്താനും എപ്പിജെനെറ്റിക്കലായി പരിഷ്കരിക്കാനും ഉപയോഗിക്കാവുന്ന ഒരു സാധ്യതയുള്ള ജീൻ എഡിറ്റിംഗ് ഉപകരണമാണ് CRISPR (പട്ടിക 1) (അഹമ്മദ് et al., 2021). ട്യൂമർ സപ്രസ്സറുകൾ, ഓങ്കോജീനുകൾ, മയക്കുമരുന്ന് പ്രതിരോധം എന്നിവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ജീനുകൾക്കായി തിരയുന്നതിനായി നിരവധി CRISPR സ്ക്രീനുകൾ നടത്തിയിട്ടുണ്ട്. വിവിധ TNBC ഓങ്കോജീനുകൾ എഡിറ്റ് ചെയ്യുന്നതിനായി CRISPR/Cas9 ഉപയോഗിക്കുന്നത് ചിത്രം 2 ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.
ചിത്രം 2. CRISPR/Cas9 ഉപയോഗിച്ച് വിവിധ TNBC ഓങ്കോജീനുകളുടെ ജീൻ എഡിറ്റിംഗ് ട്യൂമർ വളർച്ചയും മെറ്റാസ്റ്റാസിസും കുറയ്ക്കുന്നതിലേക്ക് നയിക്കുന്നു. ഈ ഓങ്കോജീനുകളിൽ CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4, CXCR7, Crypto1, ROR1, ST8SIA എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു, ഇവ TNBC യുടെ സംഭവവികാസത്തിലും മെറ്റാസ്റ്റാസിസിലും ഉൾപ്പെടുന്നു.
കാൻസർ സെൽ മൈഗ്രേഷൻ, അധിനിവേശം, എപ്പിത്തീലിയൽ-മെസെൻചൈമൽ ട്രാൻസിഷൻ (EMT) എന്നിവ ITGA9 മായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. നോച്ച് പാതയിൽ ITGA9 ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നുണ്ടെന്നും റാബ്ഡോമിയോസാർകോമ മെറ്റാസ്റ്റാസിസിൽ രസകരമായ പങ്ക് വഹിക്കുന്നുണ്ടെന്നും മുൻ പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട് (Molist et al., 2020). കൂടാതെ, സ്തനാർബുദം ഉൾപ്പെടെ നിരവധി ട്യൂമർ തരങ്ങളിൽ രോഗിയുടെ രോഗനിർണയവുമായി ITGA9 അടുത്ത ബന്ധമുള്ളതായി കണ്ടെത്തി (Wang Z. et al., 2019). കൂടാതെ, ITGA9 ന്റെ ബയോഇൻഫോർമാറ്റിക്സ് വിശകലനം കാണിക്കുന്നത് TNBC യിൽ അതിന്റെ പ്രകടനം മറ്റ് സ്തനാർബുദ ഉപവിഭാഗങ്ങളെ അപേക്ഷിച്ച് വളരെ കൂടുതലാണെന്നാണ്. ഉയർന്ന ITGA9 ലെവലുകൾ TNBC രോഗികളിൽ ട്യൂമർ മെറ്റാസ്റ്റാസിസുമായും പുനരധിവാസവുമായും ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. CRISPR/Cas9 വഴി ITGA9 ന്റെ നോക്കൗട്ട് കാൻസർ സ്റ്റെം സെൽ (CSC) പോലുള്ള ഗുണങ്ങൾ, ട്യൂമർ ആൻജിയോജെനിസിസ്, ട്യൂമർ വളർച്ച, TNBC യിൽ β-കാറ്റെനിൻ ഡീഗ്രഡേഷൻ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിലൂടെ മെറ്റാസ്റ്റാസിസ് കുറയ്ക്കൽ എന്നിവയ്ക്ക് കാരണമായി (Wang Z. et al., 2019).
ക്രിപ്‌റ്റോ-1 TGF-β കുടുംബത്തിലെ അംഗമാണ്, കൂടാതെ ആദ്യകാല ഭ്രൂണജനനം, സ്റ്റെം സെൽ പരിപാലനം, കാൻസർ മെറ്റാസ്റ്റാസിസ് എന്നിവയ്ക്ക് ഇത് നിർണായകമാണ് (ഇഷി മറ്റുള്ളവരും, 2021). Tdgf-1 എന്നും അറിയപ്പെടുന്ന ഇത്, പ്രൈമിറ്റീവ് സ്ട്രീക്ക്, മെസോഡെം, എൻഡോഡെർം എന്നിവയുടെ രൂപീകരണത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിലും ഭ്രൂണജനന സമയത്ത് ശരീരാവയവങ്ങളുടെ വികാസത്തിൽ ഇടത്/വലത് അസമമിതി സ്ഥാപിക്കുന്നതിലും ഉൾപ്പെടുന്ന ഒരു ഓങ്കോജെനിക് GPI-ആങ്കർ ചെയ്ത സിഗ്നലിംഗ് പ്രോട്ടീനാണ് (Zhang മറ്റുള്ളവരും, 2021b). കൂടാതെ, ക്രിപ്‌റ്റോ-1 ഒരു സ്റ്റെം സെൽ മാർക്കറായി എപ്പിത്തീലിയൽ-മെസെൻചൈമൽ സംക്രമണത്തിൽ (EMT) ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട് (Zhang മറ്റുള്ളവരും, 2021b). ഭ്രൂണ വികസനം, ഫൈബ്രോസിസ്, മുറിവ് ഉണക്കൽ തുടങ്ങിയ വിവിധ പ്രക്രിയകൾക്ക് മാത്രമല്ല, കാൻസർ അധിനിവേശത്തിനും മെറ്റാസ്റ്റാസിസിനും EMT നിർണായകമാണ്. കൂടാതെ, ക്രിപ്‌റ്റോ-1 നാല് നോച്ച് റിസപ്റ്ററുകളുമായി ഇടപഴകുകയും അവയുടെ പോസ്റ്റ്-ട്രാൻസ്ലേഷണൽ പക്വത വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നതായി കാണിച്ചിരിക്കുന്നു (ബ്രാൻഡ്‌സ്റ്റാഡറും മെയിലാർഡും, 2019). മനുഷ്യ സ്തനാർബുദ കോശങ്ങളുടെ പരിപാലനത്തിൽ നോച്ച് സിഗ്നലിംഗ് പാത ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്നതായി അറിയപ്പെടുന്നു. ക്രിപ്‌റ്റോ-1 ന്റെ CRISPR/Cas9- മധ്യസ്ഥതയിലുള്ള നോക്കൗട്ട് കാൻസർ വളർച്ചയെയും മെറ്റാസ്റ്റാസിസിനെയും അടിച്ചമർത്തുന്നുവെന്ന് പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്. അതിനാൽ, ക്രിപ്‌റ്റോ-1 ടിഎൻബിസിയുടെ ഒരു പ്രധാന ചികിത്സാ ലക്ഷ്യമായി മാറിയേക്കാം (കാസ്ട്രോ മറ്റുള്ളവരും, 2015).
XCL12 പ്രോട്ടീനും അതിന്റെ കീമോകൈൻ റിസപ്റ്റർ CXC (CXCR4, CXCR7) ഉം കാൻസർ കോശ വ്യാപനം, വളർച്ച, കുടിയേറ്റം, അധിനിവേശം എന്നിവയിൽ വിവിധ പങ്കു വഹിക്കുന്നു (Wu et al., 2015). ഇൻ വിവോ, ഇൻ വിട്രോ മോഡലുകളിൽ ഒന്നിലധികം സിഗ്നലിംഗ് പാതകളിലൂടെ TNBC യുടെ വികസനവുമായി ഈ കീമോസെപ്റ്ററുകൾ ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (Wu et al., 2015). കൂടാതെ, CXCR4, CXCR7 എന്നിവയുടെ സജീവമാക്കൽ TNBC-യിൽ മെറ്റാസ്റ്റാസിസിന് കൂടുതൽ സാധ്യതയും മോശം രോഗനിർണയവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (Karn et al., 2022). അതിനാൽ, TNBC ഉൾപ്പെടെയുള്ള സ്തനാർബുദ ചികിത്സയ്ക്കായി CXCR4, CXCR7 എന്നിവയുടെ നോക്കൗട്ട് ഫലപ്രദമായ മയക്കുമരുന്ന് ലക്ഷ്യ ജീനുകളായി മാറിയേക്കാം. യാങ് തുടങ്ങിയവർ നടത്തിയ പഠനം. CXCR4, CXCR7 ജീനുകളെ ഒരുമിച്ച് പുറത്താക്കാൻ യാങ് തുടങ്ങിയവർ (2019) CRISPR/Cas9 ഉപയോഗിച്ചു, TNBC വ്യാപനം, വളർച്ച, കുടിയേറ്റം, അധിനിവേശം എന്നിവ ഗണ്യമായി തടഞ്ഞുവെന്ന് കണ്ടെത്തി (Yang et al., 2019).
സ്തനാർബുദ കലകളിൽ TNBC ഓങ്കോജീനായ miR-3662 ന്റെ അളവ് വർദ്ധിച്ചതായി നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു (Yi et al., 2022). miR-3662 ന്റെ നോക്ക്ഡൗൺ ഇൻ വിവോയിലും ഇൻ വിട്രോയിലും സ്തനാർബുദ ട്യൂമർ വളർച്ചയെയും മെറ്റാസ്റ്റാസിസിനെയും തടയുന്നതായി കാണിച്ചിരിക്കുന്നു (അഗർവാളും ഗുപ്തയും, 2021). Wnt/-catenin സിഗ്നലിംഗിന്റെ ശക്തമായ ഒരു ഇൻഹിബിറ്ററാണ് HBP-1, കൂടാതെ TNBC കോശങ്ങളുടെ miR-3662- മധ്യസ്ഥ വളർച്ചയ്ക്ക് ഇത് കാരണമാകാം. അടുത്തിടെ, TNBC കോശങ്ങളിലെ Wnt/-catenin സിഗ്നലിംഗ് പാതയെ miR-3662-HBP1 അച്ചുതണ്ട് നിയന്ത്രിക്കുന്നുവെന്ന് Yi et al. കണ്ടെത്തി (Yi et al., 2022). ട്യൂമർ-നിർദ്ദിഷ്ട എക്സ്പ്രഷൻ കാരണം, miR-3662 TNBC യുടെ ഒരു സാധ്യതയുള്ള ചികിത്സാ ലക്ഷ്യമായിരിക്കാം. അതിനാൽ, TNBC യുടെ ചികിത്സയ്ക്കായി പുതിയ മരുന്നുകൾ വികസിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു മികച്ച സമീപനമായിരിക്കാം miR-3662 ന്റെ CRISPR/Cas9- മധ്യസ്ഥതയിലുള്ള നോക്ക്ഡൗൺ.
UBR5 എന്നത് 300 kDa ന്യൂക്ലിയോഫോസ്ഫോപ്രോട്ടീൻ ആണ്, ഇത് വിവിധ കാൻസറുകളിൽ ട്യൂമറിജെനിസിസ്, മെറ്റാസ്റ്റാസിസ്, രോഗപ്രതിരോധ പ്രതികരണം എന്നിവയുടെ ഒരു പ്രധാന റെഗുലേറ്ററായി തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട് (ഷിയറർ തുടങ്ങിയവർ, 2015; ഫു തുടങ്ങിയവർ, 2023). TNBC സാമ്പിളുകളിൽ UBR5 വളരെ ഉയർന്ന തോതിൽ നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുന്നതായും അതിന്റെ യൂബിക്വിറ്റിൻ ലിഗേസ് പ്രവർത്തനത്തിലൂടെ വ്യാപനം പ്രേരിപ്പിച്ചുകൊണ്ട് ERα പ്രവർത്തനത്തെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നതായും റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട് (ബോൾട്ട് തുടങ്ങിയവർ, 2015). പ്രാഥമിക TNBC സാമ്പിളുകളുടെ മുഴുവൻ എക്സോം സീക്വൻസിംഗ് പഠനങ്ങളും UBR5 ന്റെ വർദ്ധിച്ച പ്രകടനത്തെ കാണിച്ചു, ഇത് TNBC യുടെ വികസനത്തിൽ അതിന്റെ പങ്ക് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. കൂടാതെ, CRISPR/Cas9-ഡ്രൈവുചെയ്ത UBR5 ഇല്ലാതാക്കൽ TNBC മെറ്റാസ്റ്റാസിസിന്റെയും പരീക്ഷണാത്മക മൗസ് മോഡലുകളിലെ വളർച്ചയുടെയും ഗണ്യമായ തടസ്സം കാണിച്ചു. മാത്രമല്ല, ഒരു വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് മൗസ് മോഡലിൽ UBR5 ഉൾപ്പെടുത്തുന്നത് അതിന്റെ പൂർണ്ണ പ്രവർത്തനക്ഷമത പുനഃസ്ഥാപിച്ചു, അതേസമയം നിർജ്ജീവമാക്കിയ മ്യൂട്ടന്റ് സ്ട്രെയിനുകളിൽ ഈ പ്രഭാവം നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടില്ല (ലിയാവോ തുടങ്ങിയവർ, 2017). UBR5 ന്റെ അഭാവം, ആൻജിയോജെനിസിസ് മോശമായതിനാൽ TNBC യിൽ വർദ്ധിച്ച അപ്പോപ്റ്റോസിസ്, നെക്രോസിസ്, ട്യൂമർ വളർച്ച തടയൽ എന്നിവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. UBR5 ന്റെ നഷ്ടം കാരണം, വിദൂര അവയവങ്ങളിലേക്കുള്ള ട്യൂമർ വ്യാപനം കുറയുന്നു, കൂടാതെ E-കാതറിൻ എക്സ്പ്രഷൻ കുറയ്ക്കുന്നതിലൂടെ UBR5 അസാധാരണമായ EMT ഉണ്ടാക്കുന്നു (Zhang and Weinberg, 2018). അടുത്തിടെ, E3 ubiquitination പ്രവർത്തനത്തിന്റെ അഭാവം കാരണം TNBC യിൽ IFN-γ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് PDL1 ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനിൽ UBR5 വളരെ പ്രധാനപ്പെട്ട ഘടകമാണെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടു. IFN-γ പാതയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ജീനുകളിൽ UBR5 ന് വ്യവസ്ഥാപരമായ ഫലങ്ങൾ ഉണ്ടാകാമെന്നും പ്രോട്ടീൻ കൈനേസ് RNA (PKR), അതിന്റെ സിഗ്നൽ ട്രാൻസ്ഡ്യൂസറുകൾ, ആക്റ്റിവേറ്ററുകൾ എന്നിവയുടെ ആക്റ്റിവേഷൻ ലെവലുകൾ വർദ്ധിപ്പിച്ച് PDL1 ട്രാൻസാക്റ്റിവേഷൻ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കാമെന്നും RNA ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ 1 (STAT1), ഇന്റർഫെറോൺ റെഗുലേറ്ററി ഫാക്ടർ 1 (IRF1) എന്നിവ വെളിപ്പെടുത്തി. എന്നിരുന്നാലും, CRISPR/Cas9 മധ്യസ്ഥതയിലുള്ള UBR5, PD-L1 എക്സ്പ്രഷൻ എന്നിവയുടെ സംയോജിത അബ്ലേഷന് ബ്ലോക്കേഡിനെക്കാൾ ഒരു സിനർജിസ്റ്റിക് ചികിത്സാ ഫലമുണ്ട്, ഇത് ട്യൂമർ മൈക്രോ എൻവയോൺമെന്റിൽ ആഴത്തിലുള്ള സ്വാധീനം ചെലുത്തുന്നു (Wu et al., 2022). അതിനാൽ, UBR5 പ്രവർത്തനത്തെ തടയുന്നതിനും അതുവഴി TNBC മെറ്റാസ്റ്റാസിസും ട്യൂമർ വളർച്ചയും അടിച്ചമർത്തുന്നതിനും CRISPR/Cas9 ഒരു പ്രധാന ഉപകരണമായിരിക്കാം.
ROR1 എന്നത് ഒരു തരം I ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ പ്രോട്ടീനാണ്, ഇത് കാൻസറിലും ഭ്രൂണ വികാസത്തിലും പ്രകടമാകുന്നു, ഇത് ഒരു ഓങ്കോഫെറ്റൽ പ്രോട്ടീനായി തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട് (നിക്കോളാസ് ബോർച്ചർഡിംഗ്, 2014). വിവിധ മനുഷ്യ കാൻസറുകളുടെ ആക്രമണാത്മക സ്വഭാവം ROR1 ന്റെ അപ്‌റെഗുലേഷനുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. ROR1 ലക്ഷ്യമിടുന്ന ചികിത്സാ സംയുക്തങ്ങൾ ഉൾപ്പെടുന്ന ഇൻ വിവോ, ഇൻ വിട്രോ പഠനങ്ങളിൽ നിന്ന് വാഗ്ദാനകരമായ ഫലങ്ങൾ ലഭിച്ചിട്ടുണ്ട് (Chien et al., 2016). സ്തനകലകളിലെ ബയോപ്‌സികളിൽ ROR1 mRNA യുടെ ഉയർന്ന അളവ് ആക്രമണാത്മക ബേസൽ പോലുള്ള ബ്രെസ്റ്റ് (BL) ട്യൂമറുകളുമായും ശരീരത്തിന്റെ മറ്റ് ഭാഗങ്ങളിലേക്കുള്ള അവയുടെ കുടിയേറ്റവുമായും ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. മാത്രമല്ല, TNBC യുടെ വികസനത്തിനുള്ള ഒരു പ്രോഗ്നോസ്റ്റിക് മാർക്കറായി ROR1 ന്റെ അമിതമായ എക്സ്പ്രഷൻ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട് (Chien et al., 2016). എന്നിരുന്നാലും, TNBC വളർച്ചയെയും മെറ്റാസ്റ്റാസിസിനെയും അടിച്ചമർത്താൻ CRISPR/Cas9 ഉപയോഗിച്ച് ROR1 നിശബ്ദമാക്കുന്നത് ഫലപ്രദമായ ഒരു തന്ത്രമായിരിക്കും.
സിയാലിലേഷൻ പ്രക്രിയയിൽ ഗ്ലൈക്കോകോൺജുഗേറ്റുകളിൽ സിയാലിക് ആസിഡ് ചേർക്കുന്നത് ഉൾപ്പെടുന്നു, ഇത് സിയാലിട്രാൻസ്ഫെറസുകൾ (എസ്ടി) ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നു. എസ്ടി കുടുംബത്തിൽ പെടുന്ന എസ്ടി 8 എസ്ഐഎ 1 ലിംഫോസൈറ്റിക് ലുക്കീമിയ, കൊളോറെക്ടൽ കാൻസർ തുടങ്ങിയ വിവിധ രോഗങ്ങളുടെ രോഗകാരികളിൽ ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നു (ചാങ് എറ്റ് ആൽ., 2018). ടിഎൻബിസി രോഗികളുടെ സ്തനകലകളിൽ എസ്ടി 8 എസ്ഐഎ 1 വളരെ പ്രകടമാണെന്നും ട്യൂമർ സപ്രസ്സർ ജീൻ പി 53 ലെ മ്യൂട്ടേഷനുകളുമായി ഇത് പോസിറ്റീവ് ആയി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്നും ആർഎൻഎ സീക്വൻസ് വിശകലനം കാണിക്കുന്നു, ഇത് ടിഎൻബിസിയുടെ രോഗകാരിക്ക് കാരണമായേക്കാം (ബട്ടുല എറ്റ് ആൽ., 2017). കൂടാതെ, ടിഎൻബിസിയുടെ മെറ്റാസ്റ്റാസിസിലും ആവർത്തനത്തിലും ST8 എസ്ഐഎ 1 ഉൾപ്പെടുന്നു, ഇത് ടിഎൻബിസിയുടെ സംഭവവികാസത്തിലും വികാസത്തിലും ഇത് ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നുണ്ടെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ടിഎൻബിസിയുടെ ഒരു ഇൻ വിട്രോ മോഡലിൽ, സിആർഐപിഎസ്ആർ/കാസ് 9 വഴി എസ്ടി 8 എസ്ഐഎ 1 ന്റെ നോക്ക്ഡൗൺ വളർച്ചയെയും മെറ്റാസ്റ്റാസിസിനെയും തടയുന്നതായി കാണിച്ചു (ബട്ടുല എറ്റ് ആൽ., 2017). ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് ടിഎൻബിസി ചികിത്സയിൽ ST8SIA1 ഓങ്കോജീനിന്റെ പ്രവർത്തനത്തെ തടയുന്നതിനുള്ള ഒരു പ്രധാന ഉപകരണമാണ് CRISPR/Cas9 എന്നാണ്.
NAT1 ഒരു മെറ്റബോളിക് എൻസൈമാണ്, ഇത് ഘട്ടം II സെനോബയോട്ടിക് സംയുക്തങ്ങളുടെ രൂപീകരണത്തെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് മിക്കവാറും എല്ലാ മനുഷ്യ കലകളിലും പ്രകടമാണ്. ആരോമാറ്റിക് അമിൻ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റിന്റെ അഭാവത്തിൽ പോലും അസറ്റൈൽ-CoA (അസറ്റൈൽ-CoA) ലക്ഷ്യമിടാൻ NAT1-ന് കോഫാക്ടർ ഫോളേറ്റ് ഉപയോഗിക്കാൻ കഴിയും (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). സ്തനാർബുദ കോശ മാതൃകകളിൽ മാട്രിക്സ് മെറ്റലോപ്രോട്ടീനേസ് 9 (MMP9) പ്രവർത്തനത്തെ NAT1 നിയന്ത്രിക്കുകയും ഗ്ലൂക്കോസ് പട്ടിണി സമയത്ത് റിയാക്ടീവ് ഓക്സിജൻ സ്പീഷീസുകളിൽ (ROS) നിന്ന് സംരക്ഷിക്കുകയും ചെയ്യുന്നുവെന്ന് പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട് (Wang et al., 2018). NAT1 ഇല്ലാതാക്കുന്നത് പൈറുവേറ്റ് ഡീഹൈഡ്രജനേസ് സമുച്ചയത്തെ തടയുന്നതായി കാണിച്ചിരിക്കുന്നു, ഇത് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതതയിലേക്ക് നയിക്കുന്നു (Wang L. et al., 2019). കൂടാതെ, ചെറിയ തന്മാത്രകൾ ഉപയോഗിച്ചുള്ള NAT1 ഇൻഹിബിഷനും siRNA നിശബ്ദമാക്കലും സ്തനാർബുദ കോശങ്ങളുടെ ആക്രമണാത്മകതയും വ്യാപനവും കുറയ്ക്കാൻ സഹായിക്കുമെന്ന് മറ്റ് വിവിധ റിപ്പോർട്ടുകൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട് (Stepp et al., 2018). അടുത്തിടെ, MDA-MB-231 എന്ന സ്തനാർബുദ കോശത്തിലെ NAT1 നെ അടിച്ചമർത്താൻ CRISPR/Cas9 ഉപയോഗിച്ചു, ഇത് അതിന്റെ എക്സ്പ്രഷൻ ലെവലിനെ ആശ്രയിച്ച് സെല്ലുലാർ മെറ്റബോളിസത്തെ ബാധിക്കുന്നു. TNBC യുടെ പുരോഗതിക്കും മെറ്റാസ്റ്റാസിസിനും NAT-1 നിർണായകമാണെന്ന് ഈ പഠനം തെളിയിച്ചു (Carlisle et al., 2020).
ഓങ്കോജീനുകളുടെ ഏകോപിത ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ സൂപ്പർ എൻഹാൻസറുകൾ, ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങൾ, സഹഘടകങ്ങൾ എന്നിവയാൽ നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുന്നു (Hnisz et al., 2015). കൂടാതെ, CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, CDK13 തുടങ്ങിയ സൈക്ലിൻ-ആശ്രിത കൈനേസുകളുടെ (CDK-കൾ) ഒരു കൂട്ടം ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ നിയന്ത്രണത്തിന് ആവശ്യമാണ്. അവയിൽ, CDK7 RNA പോളിമറേസ് II ന്റെ ഫോസ്ഫോറിലേഷനിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു, ഇത് TNBC യുടെ രോഗകാരിയിൽ ഓങ്കോജീൻ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷന്റെ ആരംഭത്തിനും വികാസത്തിനും വളരെ പ്രധാനമാണ്. ഒരു സെമിനൽ പഠനത്തിൽ, CRISPR/Cas9 വഴി CDK7 ഇല്ലാതാക്കുന്നത് TNBC യെ തടഞ്ഞു, ഇത് TNBC യുടെ രോഗകാരി CDK7 ആശ്രിതമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (Wang Y. et al., 2015).
MYC, RBP (RNA ബൈൻഡിംഗ് പ്രോട്ടീൻ) എന്നിവയിലെ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ അപ്പോപ്റ്റോസിസിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാമെന്ന് പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്, അതേസമയം MYC അല്ലെങ്കിൽ RBP എന്നിവയിലെ ഒറ്റ ജീൻ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ കാൻസർ കോശങ്ങളുടെ വളർച്ചയെ ബാധിക്കുന്നില്ല (Einstein et al., 2021). CRISPR/Cas9 അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ലൈബ്രറി ഉപയോഗിച്ച് മനുഷ്യ ജീനോമിലെ 1000-ലധികം RBP-കൾ പരിശോധിച്ചു. അവയിൽ, ഉയർന്ന MYC ലെവലുകളുള്ള കാൻസർ കോശങ്ങളുടെ വളർച്ചയ്ക്ക് 57 RBP-കൾ നിർണായകമാണെന്ന് കണ്ടെത്തി (Wheeler et al., 2020). കൂടാതെ, TNBC സെൽ വളർച്ച നിലനിർത്തുന്നതിന് YTHDF2 പ്രധാനമാണ്, കൂടാതെ ഉയർന്ന MYC എക്സ്പ്രഷനുള്ള കാൻസർ കോശങ്ങളിൽ ഉയർന്ന ലെവൽ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനിലും വിവർത്തനത്തിലും മെത്തിലേറ്റഡ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളുടെ അളവ് കുറയ്ക്കുന്നു. കൂടാതെ, TNBC രോഗികളുടെ അതിജീവനം ദീർഘിപ്പിക്കുന്നതിന് ഉയർന്ന MYC ലെവലുകളെ ആശ്രയിക്കാത്ത കാൻസർ കോശങ്ങൾക്ക് YTHDF2 അത്യാവശ്യമല്ല (Einstein et al., 2021), ഇത് TNBC-യെ മറികടക്കാൻ കഴിയുന്ന മരുന്നുകളുടെ ഒരു സാധ്യതയുള്ള ചികിത്സാ ലക്ഷ്യമായിരിക്കാമെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
സിങ്ക് ഫിംഗർ പ്രോട്ടീനുകൾ (ZNF-കൾ) മൊത്തം മനുഷ്യ ജീനോമിന്റെ ഏകദേശം 1% വരും. കരൾ കാൻസർ, സ്തനാർബുദം, കൊളോറെക്ടൽ കാൻസർ തുടങ്ങിയ വിവിധ അർബുദങ്ങളിൽ ZNF-ന് കോശ വ്യാപനം നിയന്ത്രിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട് (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). CRISPR നോക്കൗട്ട് വഴി സൃഷ്ടിക്കപ്പെട്ട ലൈബ്രറികൾ സ്തനാർബുദ കോശങ്ങളിലെ വിവിധ ട്യൂമർ സപ്രസ്സർ ജീനുകൾ (TSG-കൾ) പരിശോധിക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചുവരുന്നു (Shalem et al., 2014). അതിനുശേഷം, CRISPR/Cas9 ZNF319-ൽ നിന്ന് ഇല്ലാതാക്കിയ സ്തനാർബുദ കോശങ്ങളെക്കുറിച്ചുള്ള ഒരു ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക് പഠനം കാണിക്കുന്നത് ZNF319 സ്തനാർബുദ വ്യാപനം കുറയ്ക്കുന്ന ഒരു ട്യൂമർ സപ്രസ്സർ ജീൻ ആണെന്നും അതിനാൽ വിവിധ സാധ്യതയുള്ള സിഗ്നലിംഗ് സംവിധാനങ്ങളിലും മറ്റ് ജൈവിക പ്രവർത്തനങ്ങളിലും ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്നും (Wang L. et al., 2022).
ഫെറോപ്റ്റോസിസ് എന്നത് ഇരുമ്പിന്റെ സാന്നിധ്യത്തെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്ന ഒരു തരം പ്രോഗ്രാം ചെയ്ത കോശ മരണമാണ്. ഫെറോപ്റ്റോസിസിന്റെ വികസനം ലിപിഡ് പെറോക്സൈഡുകളുടെ സാന്നിധ്യത്താൽ സ്വാധീനിക്കപ്പെടുന്നുവെന്ന് അറിയപ്പെടുന്നു. കൂടാതെ, PKCβII ആദ്യകാല ലിപിഡ് പെറോക്സൈഡേഷൻ പ്രകടിപ്പിക്കുന്നതായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്, കൂടാതെ വർദ്ധിച്ച ലിപിഡ് പെറോക്സൈഡേഷൻ ഫെറോപ്റ്റോസിസുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. CRISPR/Cas9-മധ്യസ്ഥതയുള്ള കൈനേസ് ഇൻഹിബിറ്ററുകളുടെ ഒരു ലൈബ്രറി പരിശോധിക്കുമ്പോൾ, MDA-MB-231 കോശങ്ങളിലെ ഫെറോപ്റ്റോസിസിന് നിർണായകമായ ലിപിഡ് പെറോക്സൈഡേഷൻ പ്രക്രിയയിൽ PKCβII ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്ന് വെളിപ്പെടുത്തി (Zhang et al., 2022). അതിനാൽ, CRISPR/Cas9 വഴി PKCβII ന്റെ നോട്ടൗട്ട് ഫെറോപ്റ്റോസിസ് സംബന്ധമായ രോഗങ്ങളുടെ ചികിത്സയ്ക്കുള്ള ഒരു സാധ്യതയുള്ള ട്യൂമർ സപ്രസ്സർ ജീൻ ലക്ഷ്യമായിരിക്കാം എന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (Zhang et al., 2022).
കാൻസർ രോഗികളിൽ ഏകദേശം 90% മരണങ്ങൾക്കും മരുന്ന് പ്രതിരോധം കാരണമാകുമെന്ന് വിശ്വസിക്കപ്പെടുന്നു, ഇത് കാൻസർ ചികിത്സയിലെ പ്രധാന വെല്ലുവിളികളിൽ ഒന്നാണ് (ബുക്കോവ്സ്കി തുടങ്ങിയവർ, 2020). മയക്കുമരുന്ന് ഒഴുക്ക്, ഡിഎൻഎ നന്നാക്കൽ, അപ്പോപ്‌ടോസിസ്, വിവിധ സെൽ സിഗ്നലിംഗ് പാതകൾ എന്നിവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട മതിയായ എണ്ണം ജീനുകൾ മരുന്ന് പ്രതിരോധവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്ന് ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ഹൈഡർ തുടങ്ങിയവർ, 2020). അവയിൽ, CRISPR/Cas9 ഉപകരണങ്ങൾ നിരവധി ജീനുകളെ ലക്ഷ്യം വച്ചിട്ടുണ്ട്, കൂടാതെ മരുന്ന് പ്രതിരോധം കുറയ്ക്കുന്നതിലും കാൻസർ വിരുദ്ധ ചികിത്സകളുടെ ഫലപ്രാപ്തി വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിലും വാഗ്ദാനമായ ഫലങ്ങൾ കാണിച്ചിട്ടുണ്ട് (വാഘരി-തബാരി തുടങ്ങിയവർ, 2022). കൂടാതെ, ഉയർന്ന ത്രൂപുട്ട് CRISPR/Cas9 ജീൻ നോക്കൗട്ട് സ്ക്രീനിംഗ് ലൈബ്രറികൾ സാധ്യതയുള്ള മരുന്ന് പ്രതിരോധ ജീൻ ലക്ഷ്യങ്ങളുടെ പ്രവർത്തനം പരിഷ്കരിക്കുന്നതിൽ ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട് (ഷാലെം തുടങ്ങിയവർ, 2015). പാക്ലിറ്റാക്സൽ റെസിസ്റ്റൻസ് ജീനുകളെ തിരിച്ചറിയാൻ, ആർ‌എൻ‌എ സീക്വൻസിംഗ്, ജീനോം-വൈഡ് എസ്‌ജി‌ആർ‌എൻ‌എ ലൈബ്രറി സ്ക്രീനിംഗ് എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച്, ആവർത്തിച്ചുള്ള ടി‌എൻ‌ബി‌സി ഉള്ള രോഗികളിൽ മയക്കുമരുന്ന് പ്രതിരോധവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ഹിസ്റ്റോൺ ഡീസെറ്റിലേസ് 9 (എച്ച്ഡി‌എസി 9) ഉൾപ്പെടെ എട്ട് കാൻഡിഡേറ്റ് ജീനുകളെ തിരിച്ചറിയാൻ ഉപയോഗിച്ചു (ബി തുടങ്ങിയവർ, 2020). മറ്റൊരു പഠനത്തിൽ, കാൻസർ വിരുദ്ധ മരുന്നുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുന്ന ടി‌എൻ‌ബി‌സി രോഗികളുടെ അതിജീവന സമയത്ത് ഡിസറിൻ/ത്രിയോണിൻ, ടൈറോസിൻ പ്രോട്ടീൻ കൈനേസ് (ഡി‌എസ്‌ടി‌വൈ‌കെ) എന്നിവയുടെ വർദ്ധിച്ച പ്രകടനങ്ങൾ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു. മാത്രമല്ല, ഡി‌എസ്‌ടി‌കെയുടെ CRISPR/Cas9-മധ്യസ്ഥതയിലുള്ള നോക്ക്ഡൗൺ ഇൻ വിട്രോ (SUM102PT സെല്ലുകളും MDA-MB-468 സെല്ലുകളും) മയക്കുമരുന്ന് പ്രതിരോധശേഷിയുള്ള കാൻസർ കോശങ്ങളുടെ അപ്പോപ്റ്റോസിസും ഇൻ വിവോ TNBC മോഡലും (ഓഗ്ബു തുടങ്ങിയവർ, 2021) ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിച്ചു.
TNBC ക്ക് MAPK പാതയുടെ അസാധാരണമായ സജീവമാക്കൽ ഉണ്ടെങ്കിലും, MEK-ലക്ഷ്യമിടുന്ന ചികിത്സകളുടെ ക്ലിനിക്കൽ പ്രഭാവം മോശമാണ്. CRISPR/Cas9 ജീനോമിക് ലൈബ്രറി സ്‌ക്രീനിൽ, PSMG2 (പ്രോട്ടോം അസംബ്ലി ചാപ്പറോൺ 2) ന്റെ ഇൻഹിബിഷൻ TNBC BT549, MB468 കോശങ്ങളെ MEK ഇൻഹിബിറ്ററായ AZD6244 ലേക്ക് സംവേദനക്ഷമത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് കണ്ടെത്തി. PSMG2 ന്റെ CRISPR/Cas9 നോക്ക്ഡൗൺ സാധാരണ പ്രോട്ടീസോം പ്രവർത്തനത്തെ മാറ്റിമറിച്ചു, ഇത് PDPK1 ന്റെ ഓട്ടോഫാഗി-മധ്യസ്ഥതയുള്ള ഡിസ്അസംബ്ലിംഗിലേക്ക് നയിച്ചു, അതുവഴി AZD6244 (MEK ഇൻഹിബിറ്റർ), MG132 (പ്രോട്ടോസോം ഇൻഹിബിറ്റർ) എന്നിവയാൽ പ്രേരിതമായ TNBC മൗസ് മോഡലുകളിലെ ട്യൂമർ കോശങ്ങളെ കൂടുതൽ മെച്ചപ്പെടുത്തി. അങ്ങനെ, ട്യൂമർ സെൽ വ്യാപനം കുറയ്ക്കുന്നതിന് പ്രോട്ടീസോമും MAP കൈനാസ് (MEK) ഇൻഹിബിറ്ററുകളും സിനർജിസ്റ്റിക്കലായി നൽകാം (വാങ് എക്സ്. മറ്റുള്ളവർ, 2022).
TNBC പ്രതിരോധത്തിലേക്ക് നയിക്കുന്ന ജീൻ പ്രവർത്തനം നഷ്ടപ്പെടുന്നത് പരിശോധിക്കുന്നതിനും CRISPR/Cas9 ഉപയോഗിച്ചിട്ടുണ്ട് (Shu et al., 2020). BET ബ്രോമോഡൊമൈൻ ഇൻഹിബിറ്ററായ (BBDI) JQ1 ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുന്ന കാൻസർ കോശങ്ങളുടെ മയക്കുമരുന്ന് പ്രതിരോധത്തിന്റെ സംവിധാനം TNBC-യിൽ Ge et al വിശദീകരിച്ചു. CRISPR/Cas9 ഉപയോഗിച്ച്, rb1 ജീൻ ഇല്ലാതാക്കുന്നത് TNBC കാൻസർ വിരുദ്ധ മരുന്നായ JQ1-നെ പ്രതിരോധിക്കാൻ കാരണമാകുമെന്ന് അവർ കണ്ടെത്തി. അതിനാൽ, TNBC-യിലെ JQ1 മരുന്നുകളോടുള്ള പ്രതികരണത്തിൽ rb1 പ്രവർത്തനം പ്രധാനമാണ്. പാക്ലിറ്റാക്സൽ ഒരു CDK4/6 കൈനേസ്/മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഇൻഹിബിറ്ററാണെന്നും JQ1 പോലുള്ള BBDI-കളുമായുള്ള അതിന്റെ സംയോജനം മയക്കുമരുന്ന് പ്രതിരോധശേഷിയുള്ള TNBC-ക്ക് വാഗ്ദാനമായ ചികിത്സാ പ്രതികരണങ്ങൾ നൽകിയേക്കാമെന്നും അവർ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തു (Ge et al., 2020).
TNBC-യിലെ നിയോഅഡ്ജുവന്റ് തെറാപ്പിയോടുള്ള പ്രതിരോധത്തിന് ലോങ്ങ് നോൺകോഡിംഗ് RNA (lncRNA) യുടെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ ലാൻഡ്‌സ്‌കേപ്പ് കാരണമാകുമെന്ന് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. TNBC-യിൽ അഞ്ച് വ്യത്യസ്ത MALAT1 lncRNA ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾ ഉയർന്ന തോതിൽ പ്രകടമാകുന്നുണ്ടെന്ന് ഈ പഠനം കാണിക്കുന്നു. കൂടാതെ, MALAT1 ന്റെ CRISPR/Cas9- മധ്യസ്ഥതയിലുള്ള ഇല്ലാതാക്കൽ TNBC BT-549 കോശങ്ങളുടെ പാക്ലിറ്റാക്സൽ, ഡോക്സോറുബിസിൻ എന്നിവയിലേക്കുള്ള സംവേദനക്ഷമത വർദ്ധിപ്പിച്ചു, ഇത് TNBC-യിൽ MALAT1 പ്രതിരോധത്തിന് സാധ്യതയുള്ള പങ്ക് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (Shaath et al., 2021).
BRCA1 (BRCA1m) ലെ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ വൈവിധ്യമാർന്നവയാണ്, അതിനാൽ കണ്ടെത്തുന്നത് ബുദ്ധിമുട്ടാണ്. BRCA1 ന്റെ സിന്തറ്റിക് മാരക പങ്കാളിയായ PARP1 (പോളി (ADP-റൈബോസ്) പോളിമറേസ്) ലക്ഷ്യം വയ്ക്കുന്നത് TNBC മരുന്നിന്റെ കീമോസെൻസിറ്റിവിറ്റി വർദ്ധിപ്പിച്ചേക്കാം. CRISPR/Cas9 ഉപയോഗിച്ച്, PARP1 ഇല്ലാതാക്കുന്നത് ഡോക്സോരുബിസിൻ, ജെംസിറ്റാബൈൻ, ഡോസെറ്റാക്സൽ തുടങ്ങിയ കാൻസർ വിരുദ്ധ മരുന്നുകളുടെ mBRCA1 മ്യൂട്ടന്റ് TNBC കോശങ്ങളിലേക്കുള്ള സംവേദനക്ഷമത വർദ്ധിപ്പിച്ചു, ഇത് TNBC യിലെ മയക്കുമരുന്ന് പ്രതിരോധത്തിലും PARP1 ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (വാഘരി-തബാരി തുടങ്ങിയവർ, 2022). . BRCA1 അല്ലെങ്കിൽ BRCA2 എന്ന ട്യൂമർ സപ്രസ്സർ ജീനുകളിലെ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ ആളുകളിൽ സ്തനാർബുദം വരാനുള്ള സാധ്യത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതായി അറിയപ്പെടുന്നു. ഈ രോഗികളുടെ ചികിത്സയ്ക്ക് PARP ഇൻഹിബിറ്ററുകളുടെ ഉപയോഗം ആവശ്യമാണ്. കൂടാതെ, CRISPR/Cas9 ഉപയോഗിച്ച് ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് സാൽവേജ് ഫാക്ടർ DNPH1 ന്റെ നോക്ക്ഔട്ട് വിഷാംശമുള്ള ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് 5-ഹൈഡ്രോക്സിമെഥൈൽഡിയോക്സിയുറിഡിൻ (hmdU) മോണോഫോസ്ഫേറ്റ് നീക്കം ചെയ്യാൻ സഹായിക്കുമെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്, അതുവഴി PARP ഇൻഹിബിറ്ററുകളോടുള്ള സംവേദനക്ഷമതയോടുള്ള BRCA- കുറവുള്ള കോശങ്ങളുടെ പ്രതികരണം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു (Fugger). et al., 2021). അങ്ങനെ, CRISPR/Cas9, PARP1 ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ TNBC-യുടെ ഒരു പ്രധാന ചികിത്സാ തന്ത്രമായി മാറിയേക്കാം.
പെനെട്രന്റ് ഗ്ലൈക്കോപ്രോട്ടീൻ (P-gp) ജീൻ ഒരു മൾട്ടിഡ്രഗ് റെസിസ്റ്റൻസ് ജീനാണ്, ഇത് സാധാരണയായി എല്ലാ TNBC കളിലും ഏകദേശം 41% ത്തിൽ (Sun et al., 2020) നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുന്നു. സ്തനാർബുദത്തിലെ മയക്കുമരുന്ന് പ്രതിരോധത്തിന്റെ ഒരു പ്രധാന റെഗുലേറ്ററായി P-gp-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് ഡ്രഗ് എഫ്ലക്സ് തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട്. സ്തനാർബുദത്തിലെ കാൻസർ വിരുദ്ധ മരുന്നുകളോട് P-gp ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ വർദ്ധിച്ച സംവേദനക്ഷമത പ്രകടമാക്കിയിട്ടുണ്ട് (Famta et al., 2021). അതിനാൽ, TNBC യിലെ മയക്കുമരുന്ന് പ്രതിരോധത്തെ മറികടക്കാൻ CRISPR/Cas9-മധ്യസ്ഥതയിലുള്ള അബ്ലേഷൻ അല്ലെങ്കിൽ P-gp, P-gp ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ അടിച്ചമർത്തൽ വളരെ പ്രധാനപ്പെട്ട രീതികളായിരിക്കാം.
ATP-ബൈൻഡിംഗ് കാസറ്റ് ട്രാൻസ്പോർട്ടർ G2 (ABCG2) TNBC-യിൽ മയക്കുമരുന്ന് പ്രതിരോധത്തിന് കാരണമാകുമെന്ന് അറിയപ്പെടുന്നു (Palasuberniam et al., 2015), എന്നിരുന്നാലും CRISPR/Cas9 ഉം ABCG2 സൈലൻസിംഗും ട്യൂമർ സപ്രസ്സർ ജീൻ നിഷ്ക്രിയത്വവും തമ്മിലുള്ള ബന്ധത്തെക്കുറിച്ച് നിലവിൽ റിപ്പോർട്ടുകളൊന്നുമില്ല. PTEN ABCG2 സജീവമാക്കൽ മെച്ചപ്പെടുത്തിയേക്കാം (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). അതിനാൽ, ABCG2 നീക്കം ചെയ്യാൻ CRISP/Ca9 ഉപയോഗിക്കുന്നതും ഒരു ABCG2 ഇൻഹിബിറ്ററുമായി സംയോജിപ്പിക്കുന്നതും TNBC-യിലെ മയക്കുമരുന്ന് പ്രതിരോധത്തെ മറികടക്കാൻ അനുയോജ്യമായ ഒരു ചികിത്സയായിരിക്കാം. എല്ലാ പ്രതിരോധ ജീനുകളും ലക്ഷ്യമിടുന്ന CRISPR/Cas9 നെ പട്ടിക 2 പരാമർശിക്കുന്നു.
പട്ടിക 2. കാൻസർ വിരുദ്ധ മരുന്നുകളോട് കോശങ്ങളെ സംവേദനക്ഷമതയുള്ളതാക്കുന്നതിന് CRISPR/Cas9 വിവിധ TNBC പ്രതിരോധ ജീനുകളെ ലക്ഷ്യമിടുന്നു.
കാൻസർ രോഗകാരികളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ജീൻ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ പരിശോധിക്കുന്നതിനുള്ള സാധ്യതയുള്ള ഉപകരണങ്ങളാണ് CRISPR/Cas9 ലൈബ്രറികൾ (Chan et al., 2022). ഈ സ്ക്രീനിംഗ് രീതിയിൽ (എ) ലൈബ്രറി നിർമ്മാണം, (ബി) ലെന്റിവൈറൽ ട്രാൻസ്ഡക്ഷൻ, (സി) ഫിനോടൈപ്പിക് സ്ക്രീനിംഗ്, (ഡി) ടാർഗെറ്റ് ജീൻ വിശകലനം എന്നിങ്ങനെ നാല് ഘട്ടങ്ങൾ ഉൾപ്പെടുന്നു. TNBC യിൽ MAPK പാതയുടെ അസാധാരണമായ സജീവമാക്കൽ ഉണ്ടെങ്കിലും, PTEN, RB1, TP53 പോലുള്ള ട്യൂമർ സപ്രസ്സർ ജീനുകളിൽ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ വഹിക്കുന്ന TNBC രോഗികൾക്ക് MEK ടാർഗെറ്റുചെയ്‌ത തെറാപ്പിയുടെ ക്ലിനിക്കൽ പ്രവചനം വളരെ മോശമാണ്.
കൂടാതെ, CRISPR/Cas9 ഉപയോഗിച്ചുള്ള ഒരു ജീൻ നോക്കൗട്ട് സ്‌ക്രീൻ, MDA-MB-231-ൽ ഡീഹൈഡ്രോകാട്രോളിന്റെ പ്രഭാവം മനസ്സിലാക്കാൻ, ഗ്വാട്ടിമാലൻ പൂക്കളുടെയും ഇലകളുടെയും സത്തിൽ ധാരാളമായി കാണപ്പെടുന്ന ഏറ്റവും ശക്തവും സെലക്ടീവ് തന്മാത്രയുമായ ഡീഹൈഡ്രോകാട്രോൾ പരീക്ഷിച്ചു. സെലക്ടീവ് സെൽ സൈറ്റോടോക്സിസിറ്റിയുടെ സംവിധാനങ്ങൾ. TNBC ഉപവിഭാഗങ്ങളുടെ മെസെൻചൈമൽ സ്റ്റെംനെസ് സവിശേഷതകൾ. 17β-ഹൈഡ്രോക്സിസ്റ്ററോയിഡ് ഡീഹൈഡ്രജനേസ് ടൈപ്പ് 11 എൻകോഡ് ചെയ്യുന്ന ഒരു ജീൻ ആയ HSD17B11, MDA-MB-231 കോശങ്ങളിൽ വളരെ പ്രകടമാണെന്നും MDA-MB-231 കോശങ്ങളിൽ പ്രത്യേകമായ ഡീഹൈഡ്രോഫാൽക്കറിനോൾ ഉണ്ടാക്കുമെന്നും ഈ CRISPR/Cas9-അധിഷ്ഠിത സ്‌ക്രീൻ വെളിപ്പെടുത്തി (ഗ്രാന്റ് എറ്റ്. അൽ., 2020). അതിനാൽ, സാധ്യതയുള്ള പ്രകൃതിദത്ത സംയുക്തങ്ങളുടെ കാൻസർ വിരുദ്ധ ഗുണങ്ങൾക്ക് അടിസ്ഥാനമായ സംവിധാനങ്ങളെ തിരിച്ചറിയുന്നതിൽ CRISPR/Cas9 ജീനോമിക് സ്‌ക്രീനിംഗിന് വലിയ കഴിവുണ്ടെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
കൂടാതെ, ടിഎൻബിസിയുടെ കാൻസറിനുള്ള സാധ്യതയെക്കുറിച്ച് ഒരു നിഷ്പക്ഷമായ ജീനോം-വൈഡ് ഇൻ വിവോ CRISPR/Cas9 സ്‌ക്രീൻ ഉപയോഗിച്ച് പഠിച്ചു, ഇത് ഓങ്കോജെനിക്, ട്യൂമർ സപ്രസ്സർ പാതകൾ തമ്മിലുള്ള ബന്ധം കാണിച്ചു. എംടിഒആർ, ഹിപ്പോ പാതകളുടെ പ്രധാന ഘടകങ്ങൾ ടിഎൻബിസിയിലെ ട്യൂമർ നിയന്ത്രണത്തിൽ പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നതായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. കൂടാതെ, ഇൻ വിട്രോ ഡ്രഗ്-മാട്രിക്സ് സിനർജി മോഡലും ഇൻ വിവോ രോഗിയിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ സെനോഗ്രാഫ്റ്റുകളും ഉപയോഗിച്ച് എംടിഒആർസി1/2, വൈഎപി ഓങ്കോപ്രോട്ടീൻ എന്നിവയുടെ ഫാർമക്കോളജിക്കൽ ഇൻഹിബിഷൻ ടിഎൻബിസിയുടെ രോഗകാരിത്വത്തെ ഫലപ്രദമായി തടയുന്നുവെന്ന് പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്. മാത്രമല്ല, ടോറിൻ-1-മധ്യസ്ഥതയുള്ള എംടിഒആർസി1/2 ഇൻഹിബിഷൻ മാക്രോപിനോസൈറ്റോസിസ് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു, അതേസമയം വെർട്ടെപോർഫിൻ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് YAP ഇൻഹിബിഷൻ ടിഎൻബിസി സെൽ മരണത്തിലേക്ക് നയിക്കുന്നു. ഒരുമിച്ച് എടുത്തുകാണിച്ചാൽ, ടിഎൻബിസിക്ക് നൂതനവും ഫലപ്രദവുമായ ചികിത്സകൾ തിരിച്ചറിയുന്നതിന് ജിനോം-വൈഡ് ഇൻ വിവോ CRISPR സ്‌ക്രീനിംഗിന്റെ ശക്തിയും കരുത്തും ഈ ഫലങ്ങൾ എടുത്തുകാണിക്കുന്നു (ഡായി എറ്റ് ആൽ., 2021).
ട്യൂമറിജെനിസിസിൽ രോഗപ്രതിരോധ സംവിധാനത്തിന്റെ ക്രമക്കേട് ഒരു പ്രധാന ഘടകമാണ്. ട്യൂമർ സൂക്ഷ്മ പരിസ്ഥിതിയിലെ രോഗപ്രതിരോധ കോശങ്ങളുടെ പ്രവർത്തനത്തെ തടസ്സപ്പെടുത്തുകയും രോഗപ്രതിരോധ സംവിധാനത്തെ അപകടപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്യുന്നതുൾപ്പെടെ പ്രതിരോധ സംവിധാനങ്ങളെ മറികടന്ന് കാൻസർ കോശങ്ങൾ രോഗപ്രതിരോധ ക്ലിയറൻസിൽ നിന്ന് രക്ഷപ്പെടുന്നു. അതിനാൽ, മെച്ചപ്പെട്ട രോഗപ്രതിരോധ സംവിധാനം വികസിപ്പിക്കുന്നത് ട്യൂമറുകളെ ചെറുക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു പ്രധാന സമീപനമായിരിക്കാം. CRISPR/Cas9 അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ജീൻ പരിഷ്കരണത്തിന്റെ ഉപയോഗം വ്യത്യസ്ത വീക്ഷണകോണുകളിൽ നിന്ന് രോഗപ്രതിരോധ പ്രവർത്തന വൈകല്യവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട നിരവധി പ്രശ്നങ്ങളെ അഭിസംബോധന ചെയ്യുന്നു. സ്തനാർബുദത്തിനെതിരായ ആന്റിട്യൂമർ പ്രതിരോധശേഷി മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിന് CRISPR/Cas9 ഇനിപ്പറയുന്ന വഴികളിലൂടെ ഉപയോഗിച്ചു (ചിത്രം 3).
ചിത്രം 3. CRISPR/Cas9 ഇമ്മ്യൂണോതെറാപ്പി TNBC കോശങ്ങളെ ലക്ഷ്യം വയ്ക്കുന്നു. CDK5 ന്റെ നഷ്ടവും PDL1, CD155 എന്നിവയുടെ നോക്ക്ഡൗൺ രോഗപ്രതിരോധ സംവിധാനത്തെ മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നു. അതുപോലെ, A2AR ന്റെ നഷ്ടവും HER2, mucin 1, TEM8 തുടങ്ങിയ TAA കളുടെ നോക്ക്ഡൗൺ എന്നിവയും കാൻസർ കോശങ്ങളെ കൊല്ലുന്നതിൽ CAR-T കോശങ്ങളുടെ കാര്യക്ഷമത വർദ്ധിപ്പിച്ചു. p38 കൈനേസിന്റെ തടസ്സം T സെൽ ആന്റിട്യൂമർ പ്രവർത്തനം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് CRISPR/Cas9-ഡ്രൈവൺ ചെയ്ത ടി സെൽ സ്ക്രീനിംഗ് തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്. CRISPR/Cas9 പരിഷ്കരിച്ച ടി സെല്ലുകൾ TCR (T സെൽ റിസപ്റ്റർ) ന്റെ എക്സ്പ്രഷൻ വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും അതിന്റെ ഫലമായി T കോശങ്ങൾക്ക് ആന്റിട്യൂമർ പ്രവർത്തനം ഉണ്ടാകുകയും ചെയ്യുന്നു.
രോഗപ്രതിരോധ സംവിധാനത്തെ കാൻസർ കോശങ്ങളെ ആക്രമിക്കാൻ ഉത്തേജിപ്പിക്കുക എന്നതാണ് ഇമ്മ്യൂണോതെറാപ്പിയുടെ ലക്ഷ്യം. ഇമ്മ്യൂൺ ചെക്ക്‌പോയിന്റ് പ്രോട്ടീനുകളുടെ അമിതമായ എക്സ്പ്രഷൻ സാധാരണയായി ഓട്ടോഇമ്മ്യൂൺ പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളെ തടയുന്നു, പക്ഷേ കാൻസറുകൾ അവ ഒഴിവാക്കാൻ സഹായിച്ചേക്കാം (ടോപ്പാലിയൻ തുടങ്ങിയവർ, 2015). രോഗപ്രതിരോധ കോശങ്ങളുടെ ഉപരിതലത്തിലുള്ള റിസപ്റ്ററുകളുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതിലൂടെ ഈ പ്രോട്ടീനുകൾ രോഗപ്രതിരോധ പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളെ തടയുന്നു. ഒന്നിലധികം ചെക്ക്‌പോയിന്റ് പ്രോട്ടീനുകൾ (CD155, PD-L1 പോലുള്ളവ) രോഗപ്രതിരോധ കോശങ്ങളിലെ PD-1 റിസപ്റ്ററിനെ ലക്ഷ്യം വയ്ക്കുന്നു, കൂടാതെ സ്തനാർബുദത്തിൽ, പ്രത്യേകിച്ച് TNBC-യിൽ പ്രകടമാകുന്നു (Li Y.-C. തുടങ്ങിയവർ, 2020). CRISPR/Cas9 ഉപയോഗിച്ച് PD-L1 അല്ലെങ്കിൽ അതിന്റെ റിസപ്റ്ററിന്റെ നോക്ക്ഡൗൺ ചെയ്യുന്നത് TNBC ട്യൂമറുകൾ ആക്രമിക്കാൻ രോഗപ്രതിരോധ സംവിധാനത്തെ ഉത്തേജിപ്പിക്കും (Yahata et al., 2019). കൂടാതെ, CDK5 ന്റെ CRISPR/Cas9- മധ്യസ്ഥത ഇല്ലാതാക്കൽ വഴി PD-L1 എക്സ്പ്രഷന്റെ നിയന്ത്രണം ഇൻ വിട്രോയിലും ഇൻ വിവോയിലും ട്യൂമർ വളർച്ചയെ തടയുന്നതായി കാണിച്ചിരിക്കുന്നു (ഡെങ് തുടങ്ങിയവർ, 2020). സ്തനാർബുദത്തിന്റെ ഇൻ വിട്രോ, ഇൻ വിവോ മോഡലുകളിലെ വളർച്ചാ തടസ്സം സൂചിപ്പിക്കുന്നത്, CD155 ന്റെ shRNA- മധ്യസ്ഥതയിലുള്ള കുറവ് സ്തനാർബുദത്തിൽ ഒരു ചികിത്സാ ഫലമുണ്ടാക്കിയേക്കാമെന്നാണ് (Gao et al., 2018).
ട്യൂമർ-അസോസിയേറ്റഡ് ആന്റിജനുകൾ (TAAs) തിരിച്ചറിയുന്ന CAR-കളെ CAR T സെല്ലുകൾ പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു, കൂടാതെ അവയുടെ പ്രവർത്തനം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് ചെക്ക്‌പോയിന്റ് പ്രോട്ടീനുകളുടെ നോക്ക്ഡൗൺ ഉപയോഗിക്കാം (Li C. et al., 2020). സ്തനാർബുദത്തിൽ CAR T സെൽ തെറാപ്പിക്ക് HER2, mucin1, TEM8 (Bajgain et al., 2018) പോലുള്ള നിരവധി TAA-കൾ ഉൾപ്പെടെ വിവിധ സാധ്യതയുള്ള ലക്ഷ്യങ്ങളുണ്ട്. CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019) ഉപയോഗിച്ച് PD-1 നോക്ക്ഔട്ട് ചെയ്യുമ്പോൾ മെസോതെലിൻ (TNBC BT-459 സെല്ലുകളിൽ അമിതമായി എക്സ്പ്രസ് ചെയ്യപ്പെടുന്നു) ലക്ഷ്യമിടുന്ന CAR T സെല്ലുകൾ കാൻസറിനെതിരെ കൂടുതൽ ഫലപ്രദമാണെന്നതിന് തെളിവുകളുണ്ട്. എന്നിരുന്നാലും, രോഗികളിൽ നിന്ന് ടി സെല്ലുകളെ വേർതിരിച്ചെടുക്കുകയും പിന്നീട് അവയെ എക്സ് വിവോയിൽ എഡിറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നത് ഒരു അധ്വാനവും സമയമെടുക്കുന്നതുമായ പ്രക്രിയയാണ്. യൂണിവേഴ്സൽ ടി സെല്ലുകൾക്ക് ഐസൊലേഷൻ ആവശ്യകതകൾ കുറയ്ക്കാൻ കഴിയുമെങ്കിലും, ഗ്രാഫ്റ്റ്-വേഴ്സസ്-ഹോസ്റ്റ് അസാധാരണത്വങ്ങൾ തടയുന്നതിന് ഹ്യൂമൻ ല്യൂക്കോസൈറ്റ് ആന്റിജൻ (HLA) ക്ലാസ് I, ടി സെൽ റിസപ്റ്റർ (TCR) പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ദാതാവ് ടി സെല്ലുകൾ നീക്കം ചെയ്യണം (Ren et al., 2017). , 2017a). CRISPR/Cas9 ഉപയോഗിച്ച്, HDR ഒരേസമയം TCR, HLA എന്നിവ ഇല്ലാതാക്കാനും CAR എന്ന ജീൻ എൻകോഡിംഗിനെ ഇല്ലാതാക്കാനും കഴിയും. CRISPR/Cas9 ഉപയോഗിച്ച് TCR ലോക്കസിലേക്ക് ആന്റി-സിഡി 19 CAR-കൾ അവതരിപ്പിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്, അതുവഴി ടി സെല്ലുകളെ ഇല്ലാതാക്കാതെ CAR-കൾ കാര്യക്ഷമമായി ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു (ഡിമിട്രി മറ്റുള്ളവരും, 2022). TCR, ബീറ്റ-2-മൈക്രോഗ്ലോബുലിൻ (B2M), HLA-I സബ്യൂണിറ്റ്, PD-1, CTLA-4 പോലുള്ള മറ്റ് പ്രോട്ടീനുകൾ എന്നിവ ഒരേസമയം ഇല്ലാതാക്കി അലോജെനിക് CAR T സെല്ലുകൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നതിനായി മൾട്ടിപ്ലക്സ് സാങ്കേതികവിദ്യകൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്, ഇവയ്ക്ക് കൂടുതൽ കാൻസർ വിരുദ്ധ ഗുണങ്ങൾ ഉണ്ടാകാം. TNBC-ക്കെതിരെ (Eyquem മറ്റുള്ളവരും, 2017; Liu മറ്റുള്ളവരും, 2017; Ren മറ്റുള്ളവരും, 2017b; ദിമിത്രി മറ്റുള്ളവരും, 2022).
CRISPR/Cas9 ഉപയോഗിക്കുന്നത് CAR-T കോശങ്ങളുടെ ഫലപ്രാപ്തി മെച്ചപ്പെടുത്തും. അഡിനോസിന് രോഗപ്രതിരോധ ശേഷി കുറയ്ക്കുന്ന ഗുണങ്ങളുണ്ടെന്ന് അറിയപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ T സെൽ പ്രവർത്തനത്തെ തടയുന്നതിലൂടെയും അഡിനോസിൻ A2A റിസപ്റ്ററുകൾ സജീവമാക്കുന്നതിലൂടെയും കാൻസർ പ്രതിരോധശേഷി കുറയ്ക്കാൻ കഴിയും (A2AR) (Vigano et al., 2019). CRISPR/Cas9 ഉപയോഗിച്ച് A2AR നിശബ്ദമാക്കുന്നത് ഇൻ വിവോയിൽ CAR-T കോശങ്ങളുടെ ഫലപ്രാപ്തിയെ ഗണ്യമായി മെച്ചപ്പെടുത്തി (Giuffrida et al., 2021). സെല്ലുലാർ വികാസം, വ്യത്യാസം, ഓക്സിഡേറ്റീവ് സ്ട്രെസ്, ജീനോമിക് സ്ട്രെസ് തുടങ്ങിയ വിവിധ ഫിനോടൈപ്പിക് സ്വഭാവസവിശേഷതകൾ ടി സെല്ലുകൾ പ്രകടിപ്പിക്കുന്നതായി അറിയപ്പെടുന്നു. CRISPR/Cas9 അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ടി സെൽ സ്ക്രീനിംഗ് 25 വ്യത്യസ്ത ടി സെൽ റിസപ്റ്റർ കൈനേസുകളുടെ തടസ്സം വെളിപ്പെടുത്തി. അവയിൽ, p38 കൈനേസ് ഇല്ലാതാക്കുന്നത് T കോശങ്ങളുടെ ആന്റിട്യൂമർ പ്രവർത്തനം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതായി കാണിച്ചിരിക്കുന്നു, ഇത് p38 കൈനേസ് CAR-T സെൽ നിയന്ത്രണത്തിന്റെ ഒരു പ്രധാന റെഗുലേറ്ററാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ഗുരുസാമി et al., 2020).
CRISPR/Cas9 ഉപയോഗിച്ച് ഉയർന്ന പ്രകടനമുള്ള TCR-കൾ ഉത്പാദിപ്പിക്കാൻ T കോശങ്ങളെ ജനിതകമായി പരിഷ്കരിക്കാൻ കഴിയും. ജനിതകമായി പരിഷ്കരിച്ച T കോശങ്ങളെ രോഗികൾക്ക് കൈമാറുന്നത് എൻഡോജെനസ് T കോശങ്ങളേക്കാൾ ശക്തമായ കാൻസർ വിരുദ്ധ പ്രവർത്തനം കാണിക്കുന്നു. അതിനാൽ, എൻഡോജെനസ് TCR-കൾ രോഗികളിൽ ജനിതകമായി മാറ്റം വരുത്തിയ TCR-കളുമായി മത്സരിച്ചേക്കാം, ഇത് കാൻസർ ഇമ്മ്യൂണോതെറാപ്പിയുടെ സാധ്യതയെ ബാധിച്ചേക്കാം. ഈ പ്രശ്നം മറികടക്കാൻ, CRISPR/Cas9 ഉപയോഗിച്ച് സ്വീകർത്താക്കളുടെ കോശങ്ങളിലെ എൻഡോജെനസ് TCR-β നീക്കം ചെയ്യുകയും തുടർന്ന് TCR-β T കോശങ്ങളെ കാൻസർ രോഗികൾക്ക് കൈമാറുകയും ചെയ്യുന്നത് എൻഡോജെനസ് TCR ലൈംഗിക മത്സരത്തിന്റെ ആവശ്യമില്ലാതെ തന്നെ മികച്ച കാൻസർ വിരുദ്ധ രോഗപ്രതിരോധ പ്രതികരണങ്ങൾ പ്രകടിപ്പിക്കും (Fan et al. 2018). അതിനാൽ, CRISPR-പരിഷ്കരിച്ച T കോശങ്ങൾ ഒഴികെ, TCR-കൾ സാധാരണ TCR-ട്രാൻസ്ഡ്യൂസ് ചെയ്ത T കോശങ്ങളേക്കാൾ ട്യൂമർ ആന്റിജനുകളോട് ആയിരം മടങ്ങ് കൂടുതൽ സെൻസിറ്റീവ് ആണ്. കൂടാതെ, വിവിധ രക്താർബുദങ്ങളിൽ, γδ TCR+ CRISPR സൃഷ്ടിക്കുന്ന മാറ്റം വരുത്തിയ T കോശങ്ങൾ സ്റ്റാൻഡേർഡ് TCR കൈമാറ്റത്തേക്കാൾ CD4+, CD8+ T കോശങ്ങളുടെ ഉയർന്ന പ്രകടനമാണ് കാണിക്കുന്നത് (Legut et al., 2018). അതിനാൽ, CRISPR/Cas9 ഉൽ‌പാദിപ്പിക്കുന്ന പരിഷ്കരിച്ച ടി സെല്ലുകൾ TNBC യെ മറികടക്കുന്നതിനുള്ള ഫലപ്രദമായ ഇമ്മ്യൂണോതെറാപ്പി രീതിയായിരിക്കാം.
ഇന്റഗ്രിനുകൾ സെല്ലുലാർ ട്രാൻസ്മെംബ്രണുകളിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന കോശ അഡീഷൻ തന്മാത്രകളാണ്, അവ കോശങ്ങളെ എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ മാട്രിക്സുമായി (ECM) ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതിനെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നു (Hamidi and Ivaska, 2018). ഇന്റഗ്രിനുകളുടെ ക്രമക്കേട് എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ മാട്രിക്സിൽ മാറ്റം വരുത്തുന്നതിലൂടെ കാൻസർ വികസനവും കുടിയേറ്റവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, ഇത് രക്തചംക്രമണത്തിലെ കാൻസർ കോശങ്ങളുടെ അതിജീവനത്തിലേക്ക് നയിക്കുന്നു (Hamidi and Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9- മധ്യസ്ഥതയുള്ള ഇന്റഗ്രിൻ നോക്ക്ഡൗൺ TNBC-യിൽ ട്യൂമർ പുരോഗതി, മെറ്റാസ്റ്റാസിസ്, കോളനിവൽക്കരണം എന്നിവ മന്ദഗതിയിലാക്കുന്നു. ഇന്റഗ്രിൻ a5 (ITGA5) ന്റെ നോക്ക്ഡൗൺ ശ്വാസകോശ അർബുദം പോലുള്ള മറ്റ് കാൻസറുകളിൽ സെൽ മൈഗ്രേഷനും പുരോഗതിയും കുറയ്ക്കുന്നതായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട് (Ju et al., 2017), ഇത് TNBC യുടെ രോഗകാരിയിൽ ഇന്റഗ്രിൻ a5 ഒരു പ്രധാന ഘടകമാകാമെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
പരമ്പരാഗത എംബ്രിയോണിക് സ്റ്റെം (ES) സെൽ രീതികൾ ഉപയോഗിച്ച് നോക്കൗട്ട് എലികളെ സൃഷ്ടിക്കുന്നത് വളരെ സമയമെടുക്കുന്നതും കാര്യക്ഷമമല്ലാത്തതുമായ ഒരു പ്രക്രിയയാണ്. ഹോമോലോജസ് റീകോമ്പിനേഷൻ വഴി ES കോശങ്ങളെ ലക്ഷ്യം വച്ചുകൊണ്ട്, ചിമെറിക് എലികളെ പ്രജനനം ചെയ്ത്, പിന്നീട് ഹെറ്ററോസൈഗസ് എലികളുമായി അവയെ ക്രോസ് ചെയ്ത് ഹോമോസൈഗസ് സന്തതികളെ ഉത്പാദിപ്പിക്കാൻ മാസങ്ങളും വർഷങ്ങളും എടുക്കും. ഒന്നിലധികം ജനിതക മ്യൂട്ടേഷനുകളുള്ള എലികളെ സൃഷ്ടിക്കാൻ സങ്കീർണ്ണമായ ക്രോസ് ബ്രീഡിംഗ് ആവശ്യമാണ്. എന്നിരുന്നാലും, CRISPR/Cas9 ഉപയോഗിച്ച് ES കോശങ്ങളുടെ അബ്ലേഷൻ വഴിയോ CRISPR/Cas9 ഘടകങ്ങൾ ഒറ്റ-കോശ ബീജസങ്കലന മുട്ടകളിലേക്ക് മൈക്രോഇൻജെക്റ്റ് ചെയ്തുകൊണ്ടോ ജനിതക എലികളെ ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ നിരവധി പ്രശ്നങ്ങൾ ഉയർന്നുവന്നിട്ടുണ്ട്. ഉദാഹരണത്തിന്, പലപ്പോഴും ബയാലെലിക് ലോക്കിയിലാണ് മാറ്റങ്ങൾ സംഭവിക്കുന്നത്, അത് ജീൻ നിർദ്ദിഷ്ടമല്ല. CRISPR/Cas9 സാങ്കേതികവിദ്യ ഉപയോഗിക്കുന്ന ES സെല്ലുകൾക്ക് ഒരേസമയം 5 ജീനുകളിൽ വരെ ബയാലെലിക് മ്യൂട്ടേഷനുകൾ ചേർക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് അടുത്തിടെ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടു (നിഷിസോണോ തുടങ്ങിയവർ, 2021). ഈ ആവശ്യത്തിനായി, Cas9 mRNA യും അഞ്ച് ജീൻ-നിർദ്ദിഷ്ട gRNA കളും ഒരേസമയം ES കോശങ്ങളിലേക്ക് ട്രാൻസ്ഫെക്റ്റ് ചെയ്തു. ഈ പ്രക്രിയയുടെ വാഗ്ദാനവും ഫലപ്രാപ്തിയും ഇത് എടുത്തുകാണിക്കുന്നു, എന്നിരുന്നാലും ഫൗണ്ടർ ലൈനുകൾ ക്വിന്റപ്പിൾ നോക്കൗട്ട് എലികളെ ഉത്പാദിപ്പിക്കാൻ ബ്രീഡ് ചെയ്തപ്പോൾ ഈ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെട്ടിരിക്കാം. പഠനം ഒരു അത്ഭുതകരമായ കണ്ടെത്തലും റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു: ജനിതകമാറ്റം വരുത്തിയ എലികളെ സൃഷ്ടിക്കാൻ ഇനി ES സെല്ലുകൾ ആവശ്യമില്ല. പകരം, നിർദ്ദിഷ്ട ജീൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ നീക്കം ചെയ്യുന്നതിന്, Cas9 mRNA, gRNA എന്നിവ സിംഗിൾ-സെൽ സ്റ്റേജ് ഭ്രൂണങ്ങളിലേക്ക് കുത്തിവച്ചു. തൽഫലമായി, എലികളിലെ ജീൻ ഇല്ലാതാക്കലിന്റെ അനന്തരഫലങ്ങൾ പഠിക്കാൻ സൈദ്ധാന്തികമായി ഉപയോഗിക്കാവുന്ന നോക്കൗട്ട് ഫൗണ്ടർ ലൈനുകൾ സൃഷ്ടിക്കപ്പെട്ടു (Qin et al., 2016). അങ്ങനെ, പരമ്പരാഗത ജനിതക എഞ്ചിനീയറിംഗിനെ അപേക്ഷിച്ച് കുറഞ്ഞ ചെലവിൽ TNBC ചികിത്സിക്കാൻ ട്രാൻസ്ജെനിക് എലികളെ സൃഷ്ടിക്കാൻ CRISPR/Cas9 അനുവദിക്കുന്നു. CRISPR/Cas സിസ്റ്റം ഉപയോഗിച്ച്, TNBC യിലെ ഒന്നോ അതിലധികമോ എൻഡോജെനസ് ജീനുകളിൽ പോയിന്റ് മ്യൂട്ടേഷനുകൾ വിജയകരമായി അവതരിപ്പിക്കാൻ കഴിയുന്ന ഒരു പുതിയ നോക്കൗട്ട് മൗസ് മോഡൽ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്. ഈ ആശയത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കി, BRCA1, p53 എന്നിവയുടെ CRISPR/Cas9-മധ്യസ്ഥതയിലുള്ള ഇല്ലാതാക്കൽ ഉപയോഗിച്ച് TNBC യുടെ മൃഗ മാതൃകകളും വികസിപ്പിക്കാൻ കഴിയും, ഇത് HR നന്നാക്കൽ, ജീനോമിക് അസ്ഥിരത, മ്യൂട്ടന്റ് ഫിനോടൈപ്പുകൾ എന്നിവയുടെ നഷ്ടത്തിന് കാരണമാകുന്നു (Annunziato et al., 2020).
നിലവിൽ, മാമോഗ്രാഫി, മാഗ്നറ്റിക് റെസൊണൻസ് ഇമേജിംഗ് (എംആർഐ), അൾട്രാസൗണ്ട് തുടങ്ങിയ വിവിധ രീതികൾ ടിഎൻബിസി നിർണ്ണയിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, ഈ രീതികൾക്ക് ചില പരിമിതികളുണ്ട്. മെറ്റാസ്റ്റേസുകളേക്കാൾ പ്രാദേശിക സ്തനകലകൾ നിർണ്ണയിക്കാൻ മാമോഗ്രാഫി ഉപയോഗിക്കുന്നു, അവിടെ കാൻസർ കോശങ്ങൾ മറ്റ് അവയവങ്ങളിലേക്ക് കുടിയേറുന്നു. ടിഎൻബിസി നിർണ്ണയിക്കുന്നതിന് അൾട്രാസോണോഗ്രാഫി വിശ്വസനീയമായ ഒരു രീതിയല്ല (ചെൻ ആൻഡ് ലീ-ഫെൽക്കർ, 2023). അൾട്രാസൗണ്ട്, മാമോഗ്രാഫി എന്നിവയേക്കാൾ ഉയർന്ന സംവേദനക്ഷമത എംആർഐക്ക് ഉണ്ട്, പക്ഷേ അതിന്റെ രോഗനിർണയ കൃത്യത പരിമിതമാണ് (ഷാ ആൻഡ് ചെൻ, 2022). കാൻസർ കോശങ്ങളെ തിരിച്ചറിയുന്നതിനുള്ള ഒരു ആക്രമണാത്മക മാർഗമാണ് ടിഷ്യു ബയോപ്സി. എന്നിരുന്നാലും, ചില സന്ദർഭങ്ങളിൽ, സൂചി താൽപ്പര്യമുള്ള മേഖലയിൽ നിന്ന് അകന്നുപോയാൽ ഒരു ബയോപ്സിക്ക് കാൻസർ ടിഷ്യു നഷ്ടപ്പെട്ടേക്കാം. കൂടാതെ, ഇത് വളരെ ചെലവേറിയതും രോഗിക്ക് ആഘാതകരവുമാണ്. ടിഎൻബിസി ഒരു വൈവിധ്യമാർന്ന തരം കാൻസറാണ്, അതിനാൽ ഒരു ബയോപ്സി കാൻസറിന്റെ തരത്തെക്കുറിച്ച് മതിയായ വിവരങ്ങൾ നൽകിയേക്കില്ല. അതിനാൽ, ടിഎൻബിസി കണ്ടെത്തുന്നതിനുള്ള ഒരു പുതിയ രോഗനിർണയപരമായി വിശ്വസനീയമായ രീതി അടിയന്തിരമായി ആവശ്യമാണ്. സ്തനാർബുദ രോഗനിർണയത്തിന് വളരെ സെൻസിറ്റീവും കുറഞ്ഞ ആക്രമണാത്മകവുമായ ഒരു ബദലായി CRISPR/Cas9 പ്രവർത്തിച്ചേക്കാം. ഇതിനായി, TNBC രോഗനിർണയത്തിനുള്ള PCR രീതികൾ മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിന് CRISPR/Cas9 അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള തന്ത്രങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കാം. ആദ്യം, CRISPR സിസ്റ്റത്തിലെ Cas9, cpf1 പ്രോട്ടീനുകൾ നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത DNA നീക്കം ചെയ്യാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു, തുടർന്ന് ഈ രണ്ട് പ്രോട്ടീനുകൾക്കും (Cas9, cpf1) ലക്ഷ്യ DNA-യുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് PAM ശ്രേണി തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയും (ദീപക് സിംഗ് തുടങ്ങിയവർ, 2021). അങ്ങനെ, PCR-ന് കാൻസർ വികസനവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട മ്യൂട്ടേഷനുകൾ തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയും. വ്യത്യസ്ത കാൻസറുകളിലെ വ്യത്യസ്ത മ്യൂട്ടേഷനുകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിന് നിരവധി പഠനങ്ങൾ ഈ CRISPR-അധിഷ്ഠിത തന്ത്രം സ്വീകരിച്ചിട്ടുണ്ട് (Safari തുടങ്ങിയവർ, 2019). അങ്ങനെ, CRISPR-അധിഷ്ഠിത PCR രീതികൾ ബയോപ്സി അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിസ്ട്രി പോലുള്ള ആക്രമണാത്മക രീതികളിൽ TNBC രോഗനിർണയത്തിന്റെ ആശ്രിതത്വം കുറച്ചേക്കാം.
ഹോർമോൺ റിസപ്റ്റർ നിയന്ത്രണത്തിലെ ജനിതകമാറ്റങ്ങൾ TNBC യിലും പ്രകടമായിട്ടുണ്ട് (ചെൻ ആൻഡ് റുസ്സോ, 2009). പോയിന്റ്-ഓഫ്-കെയർ ഡയഗ്നോസ്റ്റിക്സിനായി മൈക്രോഅറേകൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന CRISPR/Cas9 അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള PCR തന്ത്രങ്ങൾക്ക് ഈ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ ഫലപ്രദമായി നിരീക്ഷിക്കാൻ കഴിയും (ഹാജിയാൻ തുടങ്ങിയവർ, 2019). TNBC രോഗികളിലെ നിർദ്ദിഷ്ട മ്യൂട്ടേഷനുകളെക്കുറിച്ചുള്ള പ്രസക്തമായ വിവരങ്ങൾ ആരോഗ്യ സംരക്ഷണ ദാതാക്കൾക്ക് നൽകാനും ഇത് സഹായിക്കും, ഇത് അവരുടെ ചികിത്സാ ഗതി മെച്ചപ്പെടുത്താൻ സഹായിക്കും. എന്നിരുന്നാലും, ഈ സംയോജിത സാങ്കേതികതയ്ക്ക് പരിമിതികളുണ്ട്. അതിനാൽ, TNBC രോഗനിർണയത്തിനായി ആരോഗ്യ സംരക്ഷണത്തിൽ ഈ CRISPR/Cas-PCR രീതി ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് വിപുലമായ ഗവേഷണ ശ്രമങ്ങൾ ആവശ്യമാണ് (യാങ് തുടങ്ങിയവർ, 2019).